研究背景与目的自身免疫性葡萄膜炎是世界范围内的一种常见致盲性眼病,其发生与免疫反应紊乱有关。尽管葡萄膜炎狭义地被认为是虹膜、睫状体及脉络膜的炎症,但实际上是指包含视网膜、脉络膜、玻璃体、视神经、巩膜和角膜等整个眼球组织的炎症,特别是视网膜和脉络膜是其受累主要的部位。既往研究发现,在自身免疫性葡萄膜炎中,外来抗原或视网膜抗原等危险信号激活天然免疫细胞（如眼局部的小胶质细胞,外周单核巨噬细胞和树突状细胞等）,导致血眼屏障破坏,激发眼组织内获得性免疫反应导致眼内炎症和眼组织破坏,由此导致患者视力损伤是眼视科学研究的重要课题。由于受伦理道德和法律限制,难以直接利用人体深入研究葡萄膜炎的发病机制和防治策略。因此,实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveoretinitis,EAU）动物模型则为人类葡萄膜炎发病机制和治疗防治研究提供了有效手段。目前广泛用于人类自身免疫性葡萄膜炎的动物模型主要为由视网膜抗原如光感受器间维生素A类结合蛋白（Interphotoreceptor retinoid-binging protein,IRBP）诱导易感Lewis大鼠、B10RⅢ小鼠和C57BL/6J小鼠而形成的实验性自身免疫性葡萄膜炎。例如,应用源于人IRBP1169-1191抗原肽R14可诱导Lewis大鼠呈现依赖Th1细胞免疫反应的慢性自发复发-消退性葡萄膜炎。然而,在Lewis大鼠眼组织内缺乏色素上皮细胞,大鼠EAU模型不能反映人类色素上皮细胞在葡萄膜炎中的参与作用;在B10RⅢ小鼠和C57BL/6J小鼠EAU模型中,虽然B10RIII小鼠和C57BL/6J小鼠EAU表现人类葡萄膜炎的主要特征,但在这两种小鼠的视网膜组织结构中缺乏人类主要由视锥细胞组成的视网膜中央凹,无法模拟人类中央凹视锥细胞在自身免疫反应中对视力损伤的作用。树鼩作为一种新型的模式动物,与人类在生理机能、生化代谢和基因组学等方面的相似性远高于大鼠、小鼠等实验动物,被认为是灵长类动物的近亲。另外,树鼩作为昼行性动物,在视觉系统、色彩分辨能力和眼睛构造等方面比啮齿类更接近于人类。如在眼组织解剖结构方面,树鼩视网膜光感受器细胞由具有高达95%的视锥细胞和5%的视杆细胞组成视网膜,而这些高密度的视锥细胞位于视网膜中央,类似于人类视网膜中央凹,提示树鼩将可能成为研究人类葡萄膜炎的潜在可靠的模式动物。在我们课题组前期研究中,已应用人R14和树鼩IRBP1197-1211肽段初步建立起EAU树鼩模型,但其生物学特征和干预应用有待进一步研究。因此,我们以前期建立的树鼩IRBP1197-1211抗原肽诱导的树鼩EAU作为对照,进行下述三方面内容研究:（1）筛选诱导树鼩EAU发生的其他可能抗原和免疫条件:在添加或不添加百日咳毒素的两种条件下,应用包含不同浓度的树鼩IRBP1177-1191（R16）、树鼩IRBP1169-1191（R14）、牛R14、牛R16和树鼩IRBP1197-1211的抗原肽弗式完全佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）乳化物经皮下免疫树鼩,免疫后使用裂隙灯显微镜和眼底镜观察眼内炎症发生,在炎症高峰期或仁慈终点收集眼球进行病理组织学评价,观察眼组织病理损伤,筛选建立树鼩EAU发生的诱导条件;（2）将筛选出的抗原通过低,中,高四种浓度（50μg低剂量,300μg或400μg中剂量,800μg高剂量）分别免疫树鼩,通过临床表现、组织病理学切片、苏木素伊红（H＆E）染色、免疫组织化学染色、转录组RNA测序（RNA-seq）、T淋巴细胞增殖、流式荧光微球等技术,鉴定和评价树鼩EAU的临床表现、组织病理学损伤、免疫表型以及基因表达谱等特征;（3）应用RNA-seq测序筛选出的上调表达差异基因RGS4抑制剂CCG 203769和中成药双氢青蒿素对EAU模型的干预研究,评价其应用效果。通过上述研究,以期阐明实验性自身免疫性葡萄膜炎树鼩模型的创建条件、模型特征和应用效果,为葡萄膜炎的发病机制和防治研究提供一种新的理想策略。第一部分筛选建立树鼩EAU模型的诱导条件方法1.应用低剂量50μg和100μg的树鼩R14、树鼩R16、牛R16共三种抗原肽,经包含1mg/ml或5mg/ml结核分枝杆菌（H37Ra）的CFA形成乳化物200μl经皮下免疫树鼩,腹腔不注射百日咳毒素（Pertussis Toxin,PTX）;2.应用50μg低剂量、800μg高剂量的树鼩R14、树鼩R16、牛R14三种抗原肽,经包含3.5–5 mg/ml结核分枝杆菌的CFA形成乳化物200μl通过皮下免疫树鼩,腹腔注射1000 ng的PTX。同时,应用课题组前期筛选出的树鼩IRBP1197-1211多肽按相同剂量和免疫方式诱导树鼩作为阳性对照。免疫后7天通过裂隙灯显微镜和手持式眼底镜每周两次观察树鼩眼前段和眼底的炎症发生及进展规律。进一步对有临床表现的树鼩眼组织进行病理组织学观察并确认眼组织病理损伤情况。结果1.在不添加PTX树鼩模型中,除裂隙灯观察眼前段轻微结膜充血外,眼底和眼前段未见明显炎症表现;2.添加PTX的树鼩模型中,低、中、高剂量的牛R14和树鼩IRBP1197-1211均可诱导树鼩眼前段出现结膜或睫状充血,眼底呈现视网膜变性,病理组织学观察眼组织中炎性浸润和视网膜病理损伤。而树鼩R14、树鼩R16诱导树鼩,未见明显的病理组织学损伤。结论以上结果提示,在添加PTX的条件下,低、中、高剂量的牛R14和树鼩IRBP1197-1211均可诱导出树鼩葡萄膜炎EAU的发生。第二部分EAU树鼩模型生物学特征的鉴定方法用筛选出的低（50μg）、中（300–400μg）、高（800μg）三个剂量的抗原肽牛R14和树鼩IRBP1197-1211 PBS溶液和树鼩IRBP1197-1211多肽包含3.5–5 mg/ml结核分枝杆菌的CFA乳化物200μl经皮下免疫树鼩,腹腔注射1000 ng的PTX;同时设立正常健康树鼩对照组。诱导后每周两次通过裂隙灯显微镜或应用眼底镜观察树鼩眼前段和眼底炎症的临床表现特征和疾病病程;在炎症高峰期,维持期和后期或仁慈终点取树鼩眼组织,通过病理组织切片进行H＆E染色观察EAU病理组织学特征并评分;应用免疫组织化学标记炎性细胞类型（小胶质细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞以及获得性免疫细胞CD4 T细胞和CD8 T细胞）和表达特征,用油红O,高碘酸PAS和β淀粉样蛋白（Aβ）鉴定视网膜下腔沉积物。在免疫后第25天收集EAU树鼩的脾脏组织抗原提呈细胞和T淋巴细胞,通过MTT细胞增殖试剂盒检测模型中抗原提呈细胞刺激抗原特异的T淋巴细胞的增殖反应;在免疫后炎症高峰期25天和40天,通过流式荧光微球技术评价模型血清中产生Th1细胞特征性细胞因子（IL-2、TNF-α和IFN-γ）、Th17细胞特征性细胞因子IL-17A和Th2细胞特征性细胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的情况。最后应用RNA-seq技术鉴定疾病模型中差异基因表达谱,同时应用q-PCR法验证RNA-seq测序结果的可靠性。结果用牛R14抗原和树鼩IRBP1197-1211抗原诱导出树鼩慢性EAU,疾病开始在5–15天,高峰期发生在25–45天,随后炎症持续呈慢性经过,临床表现结膜或睫状充血,持续和消失反复发生,角膜损伤,在免疫后235天仍可见虹膜前粘连;眼底轻度血管袖套、视网膜变性、视神经苍白、混浊和血管收缩。确定出其病理组织学特征表现为慢性全葡萄膜炎,炎症可累积结膜、角膜、葡萄膜和视网膜各层,结膜大量的炎性细胞灶浸润,角膜上皮或内皮粘附纤维渗出物,上皮增生或缺失,虹膜脉络膜血管扩张充血,炎性细胞浸润在血管周围,视网膜色素上皮、光感受器层以及内核层结构紊乱、折叠弯曲;色素上皮与光感受器层外节脱离、嗜酸性不定形物质沉积。在炎症后期视网膜层发生明显萎缩,感光细胞变薄、双极细胞层和神经节细胞层细胞数量减少。鉴定其免疫表型特征表现为EAU中结膜、角膜、葡萄膜和视网膜广泛浸润CD45+白细胞、CD11C+树突状细胞、Iba1+巨噬细胞、P2RY12+小胶质细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。此外,视网膜下腔沉积物阳性表达神经元变性特异性标记物Aβ。MTT检测淋巴细胞增殖实验结果显示,IRBP组在10μg IRBP抗原刺激下以及BR14组在20μg BR14抗原刺激下,诱导T细胞的显著增殖（分别对应于P=0.032,和P=0.01）。流式细胞术检测荧光微球标记结果显示,与对照组相比,在免疫后25天,50μg BR14诱导组血清中Th17型细胞因子IL-17A升高（P=0.040）;800μg BR14诱导Th2型IL-10水平降低（P=0.022）。在免疫后25天,800μg IRBP诱导组的Th1型细胞因子TNF-α和IFN-γ水平高于健康对照组（P=0.041,P=0.01）;与健康对照组相比,在免疫后40天,50μg IRBP诱导组血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平升高（P=0.034,P=0.012）。同样的,800μg IRBP诱导组中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平均升高（P=0.040,P=0.032,P=0.006）。通过RNA-Seq测序研究发现,牛R14眼组织中共表达991个差异转录本,基因本体论GO归类最显著富集于鸟苷酸（c GMP）环化酶等活性,关键的差异基因如P2RY2和腺苷酸环化酶ADCY4显著富集于细菌入侵上皮、炎性介质调节的瞬时受体电位通道（Transient receptor potential,TRP）等信号通路。树鼩IRBP1197-1211诱导EAU眼组织中共表达1046个差异转录本,排名前30的GO类别涉及超分子复合体、超分子聚合物结合、超分子纤维和微管,其中参与光感受器正常生理功能的G蛋白信号调控子4（RGS4）显著性上调。q-PCR结果显示,实验组和对照组眼组织中的差异基因表达模式与对应的RNA-Seq测序结果一致,提示RNA-Seq测序结果的准确性。结论牛R14抗原肽和树鼩IRBP1197-1211抗原肽诱导的树鼩EAU呈现慢性病程,其特征为视网膜变性损伤、伴有视网膜下Aβ沉积和小胶质细胞/巨噬细胞浸润以及T细胞反应,这可能是通过改变与细菌入侵、炎性疼痛、小胶质细胞吞噬作用以及代谢相关的重要途径和基因实现的;可为研究由高密度视锥细胞组成的视网膜中央区在人类葡萄膜炎的发生及防治中的作用提供新的策略。第三部分上调差异基因RGS4抑制剂CCG 203769和双氢青蒿素干预树鼩葡萄膜炎（EAU）的应用研究方法基于我们第二部分结果中800μg抗原诱导的EAU组织学评分高于50μg和300μg抗原诱导的树鼩组织学评分,我们选择了800μg IRBP诱导的树鼩进行干预应用的研究。应用800μg IRBP1197-1211抗原乳化物（包含5 mg/ml T.B.）和1000 ng/200μl的PTX联合免疫诱导树鼩EAU。设立CCG 203769治疗组,双氢青蒿素治疗组,溶剂治疗对照组和EAU模型对照组。CCG 203769治疗组在免疫后当天按0.137 mg/kg体重给予树鼩腹腔注射CCG 203769处理,连续3天。双氢青蒿素治疗组在免疫后当天按16 mg/kg体重给予树鼩腹腔注射双氢青蒿素治疗,每2天注射一次,连续注射免疫后25天或45天。溶剂治疗对照组是指在免疫后当天给予树鼩腹腔注射与双氢青蒿素相同体积的玉米油（包含10%DMSO）作为对照,注射至免疫后连续25天或45天。树鼩免疫后7天每周观察树鼩眼底比较干预治疗后对树鼩EAU临床表现的影响。在免疫后25和45天评价抑制剂CCG 203769和双氢青蒿素干预树鼩EAU组织病理学损伤效果。通过免疫组织化学标记染色和荧光微球标记,评价双氢青蒿素和RGS4抑制剂是否通过影响树鼩CD4和CD8细胞表达来发挥的治疗效果。结果与溶剂治疗对照组相比,用CCG 203769和DHA治疗的树鼩,EAU组织病理学评分显著降低（D25:EAU vs CCG P=0.0013EAU vs DHA P=0.0019;D45:EAU vs CCG P=0.016;EAU vs DHA P=0.0036）。而且,在CCG 203769和DHA治疗至免疫后45天显著降低树鼩EAU中CD4阳性表达（分别对应于P=0.039和P=0.018）,而对CD8阳性表达没有显著差异（P＞0.05）。进一步流式细胞术细胞因子检测发现,未观察到上述两种处理诱导树鼩血清中Th2（IL-4,IL-6和IL-10）、Th1(IL-2,TNF-α,IFN-γ和Th17（IL-17A）细胞因子谱的明显改变（P＞0.05）。结论RGS4抑制剂CCG 203769和双氢青蒿素可通过减少CD4阳性表达而发挥治疗葡萄膜炎的作用。