支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重威胁人们健康的慢性呼吸道疾病,以气道非特异性炎症、气道反应性增高及气道重塑为主要特征。据相关统计,全世界约有哮喘病人3亿,而我国目前约有2700万哮喘患者,而且患病率有逐渐上升的趋势。目前多数学者认为应把引起哮喘的诸多环境因素分为致病因素(Trigger)和诱发因素(Contributor)两大类。致病因素是指引起哮喘首次发作的因素,是哮喘发病的“扳机”和主要病因,无论在哮喘的发生和发展中均起重要作用；诱发因素是指病人在已患有哮喘的基础上诱发隐性哮喘重新活动或哮喘急性发作的因素,是哮喘发作过程中的综合诱发因素之一,在促使哮喘病情复发和进一步发展中起重要作用。在上述两大类因素中,某些因素如变应原、刺激性气体和有害气体、职业性因素、病毒、食物和药物等兼有上述双重作用,既可导致哮喘的发生,又可在哮喘病情的发展过程中起重要作用。然而,我们应当明确所有的环境因素并非是决定哮喘是否发生的唯一因素,哮喘患者本身的特应性体质也是非常重要的。患者个体的过敏体质及外界环境的双重影响是导致哮喘发病的综合危险因素。目前,很多环境因素参与哮喘的发生和发展,其中,在工业环境里受到广泛关注的是甲苯二异氰酸盐(Toluene Diisocyanate, TDI)。TDI的结构特点是带有活性很高的N=C=O基团,使其成为一种反应活性很强的化学物质,主要用于生产软质聚氨酯泡沫及聚氨酯弹性体、涂料、胶黏剂等,在家居和建筑等日常各种室内外装修中主要存在于油漆之中。据统计,异氰酸盐是引起职业性哮喘最常见的原因,且诱发的哮喘经常发展为重症哮喘,其患病率与工业发达程度密切相关。由于成本相对较低,在工业中应用最广泛的就是TDI,据统计,长期暴露于TDI环境的人群,约有57～15%发展为哮喘,而全球普通人群的哮喘患病率约为0.1%～8%,我国约为0.11%～2.03%,随着我国工业的发展,像TDI哮喘这样一些职业性哮喘的患病率也在逐年增加,其发病率之高须受到高度重视。从表现形式看,TDI哮喘的临床表现和病理变化与过敏性哮喘大致相同,但目前针对TDI哮喘的发病机制研究并不多,相关研究领域还比较局限,许多方面还不是很清楚。目前相关的研究提示TDI引起人体致敏并最终激发为哮喘包括两个主要环节：一是人们呼吸系统的支气管上皮细胞(HBE)作为直接接触TDI的主要靶细胞,在日常工业环境中经常受到低浓度的TDI刺激,当长期受到TDI刺激后,可能逐渐出现细胞结构的改变和功能的紊乱,并导致一系列生物活性分子的产生与释放,是TDI诱发哮喘的基础,在其发病机理中扮演重要角色；二是TDI所含的异氰基团与体内蛋白质的氨基结合后,生成大分子异性蛋白如TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA),成为完全抗原物质,可能通过某些中间环节渗透到粘膜下组织,然后被抗原提呈细胞提呈后进一步诱发其产生一系列活性物质、细胞因子,这些活性分子与上述HBE所产生的生物活性因子一起协同活化中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(包括Th1和Th2)、肥大细胞等炎症细胞,进而导致下游一系列与过敏性哮喘相似的炎症变态反应。我们可简单把上述两个机制概括为启动与维持,因此,对TDI哮喘发病机制尤其是启动与维持机制的深入剖析,可能为TDI哮喘的防治提供新的理论依据和作用靶点,这是对TDI哮喘能够达到有效的诊断和治疗的关键步骤。我们知道,氧化应激与哮喘的发生与发展密切相关,涉及到哮喘的自然病史、气道炎症、气道高反应性、组织损伤、气道血管通透性增加及气道重塑等。尽管如此,有关氧化应激在哮喘的致病作用及机制的研究进展缓慢。另外,HBE具有复杂的屏障功能,作为防御吸入有害物质及病原微生物的第一道防线。目前认为,其结构完整性缺陷和功能紊乱是哮喘的启动环节。哮喘病人的HBE经常处于内源性和外源性氧化应激环境当中,当HBE遭遇过度氧化应激并出现抗氧化功能紊乱时,这种平衡将被打破,从而引起固有免疫系统及获得性免疫系统的相继活化。这充分提示HBE氧化抗氧化失衡在哮喘发病中的重要作用。有实验表明：应用TDI刺激HBE可以导致细胞内还原型谷胱甘肽GSH的含量下降,显著改变了细胞的氧化还原平衡状态。通过抗氧化剂维生素C和维生素E的干预,能够减轻经TDI滴鼻豚鼠的气道炎症和嗜酸性粒细胞浸润。这提示,氧化应激在TDI致病中发挥重要作用。另外,本课题组前期体外研究已证明：应用TDI-HSA在不影响细胞活力的情况下,可显著增加正常人支气管上皮细胞(16HBE)的通透性。虽然,目前关于氧化应激与气道上皮通透性关系的研究并不多,但有证据表明：氧化应激可以明显增加肠上皮通透性。因此,我们有理由推测：TDI也可能通过氧化应激环节来增加气道上皮通透性,从而渗透到粘膜下组织参与其后续的病理调节过程。为此,本研究即在前期建立的TDI刺激HBE的体外研究模型的基础上,进一步以活性氧(ROS)为主要观察指标,探讨氧化应激对气道上皮通透性的介导作用,试图为研究TDI哮喘的发病机制提供一些理论依据。课题第一部分：甲苯二异氰酸盐对人支气管上皮细胞活性氧生成的影响方法：1、制备TDI抗原结合物：应用改良的Son M方法制备TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。2、四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的TDI-HSA对正常人支气管上皮细胞株16HBE细胞活力的影响。分组情况：对照组(不加TDI-HSA只以无血清培养基孵育),10 ug/ml TDI-HSA组,20 ug/ml TDI-HSA组,40 ug/ml TDI-HSA组,60 ug/ml TDI-HSA组,80 ug/ml TDI-HSA组,100 ug/ml TDI-HSA组,120 ug/ml TDI-HSA组,150 ug/ml TDI-HSA组(n=7)。按上述分组刺激16HBE 48h后,用MTT比色法检测细胞活力。3、观察不同浓度TDI-HSA对16HBE ROS生成的影响。分组情况：对照组(不加TDI-HSA只以无血清培养基孵育),20 ug/ml TDI-HSA组,60 ug/ml TDI-HSA组,100 ug/ml TDI-HSA组(n=3)。按上述分组刺激16HBE 24h后,胰酶消化并收集细胞,通过2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)细胞内ROS荧光染色,以流式细胞仪检测细胞内荧光强度。4、四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)对正常人支气管上皮细胞株16HBE细胞活力的影响。分组情况：正常对照组,10mmol/L NAC组,20 mmol/L NAC组,50 mmol/L NAC组,80 mmol/L NAC组(n=6)。按上述分组刺激16HBE 12h后,用MTT比色法检测细胞活力。5、观察NAC作用下TDI-HSA对16HBE ROS生成的影响。选取对ROS升高最明显的TDI-HSA浓度100 ug/ml,预先加入抗氧化剂NAC处理40 min,浓度为50 mmol/L,预处理时间结束后吸去含NAC的培养液,用无血清培养液轻轻漂洗细胞2次以除去残留的NAC,加入TDI-HSA,上述刺激24h后收集细胞,通过2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)细胞内ROS荧光染色,以荧光显微镜观察照相,流式细胞仪检测细胞内荧光强度。6、统计学方法：计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验。以P<0.05具有统计学差异。结果：1、不同TDI-HSA浓度组对16HBE细胞活力的影响：TDI-HSA浓度为10 ug/ml、20 ug/ml、40 ug/ml、60 ug/ml、80 ug/ml、100 ug/ml、120 ug/ml对16HBE活力均没有显著影响,浓度为150 ug/ml时显著降低细胞活力(P<0.05)。2、流式细胞仪检测不同浓度TDI-HSA对16HBE ROS生成的影响：20 ug/ml组、60 ug/ml组、100 ug/ml组与对照组相比,ROS的绝对荧光值显著增加(P<0.05),且随着TDI-HSA浓度的提高ROS的生成亦随之增加。3、不同NAC浓度组对16HBE细胞活力的影响：NAC在50 mmol/L浓度以内时与对照组相比对细胞活力均没有显著影响,浓度为80 mmol/L时显著降低细胞活力(P<0.001)。4、荧光显微镜观察照相、流式细胞仪检测NAC对TDI-HSA诱导16HBE ROS生成的影响：与对照组相比,100 ug/ml TDI-HSA组ROS的绝对荧光值显著增加,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05), NAC+100 ug/ml TDI-HSA组与100 ug/ml TDI-HSA组相比ROS的绝对荧光值显著减少,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组细胞内的绿色荧光十分微弱,经100 ug/ml TDI-HSA处理24h后荧光明显增强,绿色荧光弥漫着染胞质,通过NAC预处理的荧光明显减弱。结论：TDI-HSA在不影响细胞活力的情况下,呈浓度依赖性上调16HBE ROS的生成,其中以100 ug/ml浓度对ROS的影响最大,且该效应大部分被NAC预处理干预所抑制。课题第二部分：甲苯二异氰酸盐对人支气管上皮细胞通透性的影响及机制探讨方法：1、分组：对照组(不加TDI-HSA只以无血清培养基孵育),100 ug/ml TDI-HSA组,50 mmol/L NAC+100 ug/ml TDI-HSA组(n=4)。按上述分组刺激16HBE24h后,用跨上皮细胞电阻测定仪测定细胞间电阻值TEER,以反映细胞间通透性大小。2、统计学方法：计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件分析,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验。以P<0.05具有统计学差异。结果：跨上皮细胞电阻测定仪检测TDI-HSA对16HBE细胞间通透性的影响及ROS氧化应激通路在其中的介导作用：TEER在TDI-HSA组与对照组比较显著减少(P<0.001),在NAC+TDI-HSA组与TDI-HSA组比较显著增加(P<0.001)。结论：TDI-HSA明显增加16HBE间的通透性,加入抗氧化剂NAC预处理可大部分逆转该效应。TDI-HSA可经由ROS氧化应激通路增加支气管上皮细胞间的通透性。