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1、研究背景细胞代谢的改变是肿瘤的关键特征之一。大量研究表明肿瘤细胞发生了代谢重编程,包括糖代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、谷氨酰胺代谢、丝氨酸代谢、一碳单位代谢、胆碱代谢等,其中研究比较透彻的是肿瘤细胞的糖代谢。正常细胞典型的糖代谢行为是葡萄糖代谢为丙酮酸,再进入三羧酸循环生成CO2和ATP。但是肿瘤细胞糖代谢的行为是即使在氧供应充足的情况下,也会优先进行糖酵解,生成ATP的同时也为各种生物大分子的合成提供前体物质,即著名的瓦博格效应。细胞的糖代谢过程是在一系列酶促反应的精细调控下完成的。肿瘤糖代谢改变与肿瘤发生,发展和干性维持之间的关系涉及复杂的生物学过程和多种分子机制,而调控糖代谢的代谢酶的异常在其中的作用日益受到关注。m~6A RNA甲基化修饰是真核生物中含量最丰富的一种可逆RNA修饰形式。m~6A的形成是由一尚未完全解析的甲基转移酶复合体催化完成的,目前鉴定的组分包括METTL3,METTL14和WTAP。ALKB家族蛋白FTO和ALKBH5先后被证明可以去除RNA m~6A甲基化修饰。近期研究表明m~6A RNA甲基化修饰与肿瘤的发生,发展和干性维持密切相关。大量研究表明,糖代谢过程中的代谢产物可以通过直接或者间接的方式影响组蛋白的乙酰化,甲基化和DNA的甲基化,从而影响基因的表达。糖酵解代谢酶的异常表达能否通过影响m~6A RNA甲基化修饰进而调节乳腺癌肿瘤干细胞的干性维持尚无论证和阐述,有待进一步探究。2、研究方法（1）（1）瞬时敲降糖酵解限速酶,利用Western blot和Dot blot实验分别检测糖酵解限速酶的蛋白表达水平和细胞总RNA m~6A RNA甲基化的水平。（2）（1）通过测序检测PDK1基因的缺失序列。（2）敲除PDK1,Western blot检测PDK1的蛋白表达水平。（3）敲除PDK1,Dot blot检测总RNA m~6A RNA甲基化水平。（4）敲除PDK1,Dot blot检测m RNA m~6A RNA甲基化水平。（5）高表达PDK1,Western blot检测PDK1的蛋白表达水平。（6）高表达PDK1,Dot blot检测细胞总RNA的m~6A RNA甲基化水平。（3）（1）过表达野生型PDK1（PDK1-WT）,激酶失活型PDK1（PDK1-MUT）和线粒体定位序列缺失型PDK1（PDK1-DEL）,Western blot检测PDK1的蛋白表达水平。（2）过表达各种形式的PDK1质粒,Dot blot检测总RNA m~6A RNA甲基化水平。（4）（1）瞬时敲降PDK1,Western blot检测m~6A RNA修饰的writer和eraser的蛋白表达水平（2）稳定敲降PDK1,Western blot检测FTO和PDK1的蛋白表达水平。（3）敲除PDK1,Western blot检测FTO和PDK1的蛋白表达水平。（5）（1）通过体外微球悬浮培养富集乳腺癌肿瘤干细胞群,利用Western blot的方法,比较“干性”群体与非“干性”群体中FTO和C-MYC的蛋白表达水平;（2）通过体外微球悬浮培养富集乳腺癌肿瘤干细胞群,利用免疫荧光的方法,比较“干性”群体与非“干性”群体中FTO的表达和定位;（3）利用在线生存分析软件PROGgene V2分析FTO的表达与乳腺癌患者的总体生存率的相关性。（4）利用Western blotting方法检测6对乳腺癌及癌旁组织标本中FTO的蛋白表达水平。（6）（1）瞬时敲降FTO,Western blot检测FTO以及干性基因C-MYC,OCT4的蛋白表达水平。（2）通过测序检测FTO基因的缺失序列。（3）敲除FTO,Western blot检测FTO以及干性基因C-MYC,OCT4的蛋白表达水平。（4）敲除FTO,利用流式分选的方法检测ALDH+细胞群的比例。（5）稳定敲降FTO,Western blot检测FTO的蛋白表达水平;并利用体外微球悬浮培养实验,检测FTO表达变化对乳腺癌细胞微球形成能力的影响;极限稀释实验,检测FTO表达变化对乳腺癌细胞成球能力的影响。（7）（1）火山图分析PDK1表达变化产生的差异基因。（2）对PDK1表达变化产生的差异基因进行GO分析。（8）（1）通过生物信息学分析,筛选受PDK1调控的m~6A RNA甲基化修饰的干性基因。3、研究结果（1）（1）糖酵解限速酶GLUT1,HK2,PFK和LDHA对乳腺癌肿瘤细胞的m~6A RNA甲基化修饰无影响;糖酵解限速酶PFK和PDK1显著抑制乳腺癌肿瘤细胞总RNA m~6A RNA甲基化水平。（2）（1）测序结果表明我们建立了PDK1基因敲除的乳腺癌细胞系。（2）Western blot实验结果表明PDK1 KO细胞不表达PDK1蛋白。（3）Dot blot结果表明敲除PDK1可显著促进细胞总RNA m~6A RNA甲基化水平。（4）Dot blot结果表明敲除PDK1可显著促进细胞m RNA m~6A RNA甲基化水平。（5）Western blot实验验证细胞PDK1高表达。（6）Dot blot实验结果表明高表达PDK1可显著抑制细胞总RNA的m~6A RNA甲基化水平。（3）（1）Western blot验证各种形式PDK1的高表达。（2）Dot blot实验结果表明PDK1抑制细胞总RNA m~6A RNA甲基化水平与其激酶活性有关,而与其线粒体定位无关。（4）（1）Western blot结果表明PDK1瞬时敲降后,m~6A RNA去甲基化酶FTO的蛋白水平显著下调。（2）Western blot结果表明PDK1稳定敲降后,m~6A RNA去甲基化酶FTO的蛋白水平显著下调。（3）Western blot结果表明PDK1敲除后,m~6A RNA去甲基化酶FTO的蛋白水平显著下调。（5）（1）Western blot结果表明FTO和C-MYC在干性细胞群中高表达（2）免疫荧光实验结果表明FTO在干性细胞群中高表达;（3）生存分析表明,FTO的表达与乳腺癌患者的总体预后呈负相关。P=0.0189具有统计学差异。（4）Western blotting结果表明FTO在乳腺癌肿瘤组织中高表达。（6）（1）Western blot结果表明FTO瞬时敲降后,干性基因C-MYC,OCT4的蛋白表达水平下调。（2）测序结果表明我们建立了FTO基因敲除的乳腺癌细胞系。（3）Western blot结果表明FTO敲除后,干性基因C-MYC,OCT4的蛋白表达水平下调。（4）流式分选的实验结果表明FTO敲除之后,ALDH+细胞群的比例显著下调。（5）Western blot实验验证FTO的蛋白表达水平显著下调;微球形成实验结果表明FTO稳定敲降之后,细胞的成球能力显著下调;极限稀释实验,也证实FTO稳定敲降之后,细胞的成球能力显著下调。（7）（1）稳定敲降PDK1之后,共有343个差异基因,其中正相关基因209个,负相关基因134个。（2）GO分析发现差异基因参与的生物学功能主要包括细胞运输,定位和对各种环境刺激的响应（8）（1）通过生物信息学分析发现受PDK1调控的m~6A RNA甲基化修饰靶点有两个,SQSTM1和EXT1。4、研究结论（1）PDK1可以显著抑制乳腺癌肿瘤细胞的m~6A RNA甲基化修饰水平;（2）PDK1促进m~6A RNA去甲基化酶FTO的蛋白表达;（3）FTO对乳腺癌肿瘤细胞的“干性”维持起重要作用;（4）受PDK1调控的可以发生m~6A RNA甲基化修饰的基因有两个,SQSTM1和EXT1。