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水稻白叶枯病是由水稻黄单胞致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzaae,Xoo)引起的水稻上常见的细菌性病害。目前,用于防治水稻白叶枯病的药剂品种较少,且抗药性逐年增加,急需开发具有新靶标或作用机制的绿色杀菌剂。以病原物体内关键功能蛋白为分子靶标,筛选发现具有特异性强的小分子化合物,是新型绿色杀菌剂创制的重要策略。近年来,随着分子生物学技术的发展,细菌脂肪酸生物合成途径(FASII)中所涉及的关键酶逐渐引起广泛关注,其与真核生物中多功能脂肪酸合酶不同,为多个单功能酶组成,因此具有选择性抑制的特点。β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(β-ketoacyl-acyl carrier protein ACP synthase Ⅲ,FabH)控制着细菌脂肪酸生物合成的起始步骤,催化丙二酸单酰-ACP与乙酰-CoA缩合形成β-酮脂酰-ACP,是细菌脂肪酸生物合成的关键酶。通过抑制FabH活性,可干扰细菌脂肪酸生物合成,进而抑制细菌生长和繁殖。本研究针对水稻黄单胞菌FabH,利用固定化技术,制成亲和色谱柱,与HPLC联用成功分离出对FabH和水稻黄单胞菌有明显抑制活性的天然产物,并且通过温室盆栽实验验证了化合物对水稻白叶枯病具有显著的防效。具体研究内容包括:第一,本论文对水稻黄单胞菌的FabH、FabD及ACP蛋白的异源表达及纯化条件进行优化,得到水稻黄单胞菌FabH(FabHXoo)、FabD(FabDXoo)最佳纯化条件分别为55mM咪唑第一次洗脱,20mM咪唑第一次洗脱,250mM咪唑高浓度洗脱,ACP通过强阴离子交换获得。第二,采用离子交联法制备载体,并通过扫描电子显微镜,透射电子显微镜,红外光谱仪,比表面积及粒径分析仪对制备完成的壳聚糖载体进行了表征。通过对影响固定化酶的温度耐受性、pH范围、持效期等因素的研究,我们发现与游离酶相比,固定化酶在温度耐受性、pH范围及持效期方面均有显著提升。第三,从本实验室保存的120株内生真菌中筛选出对水稻白叶枯病菌及FabH具有良好活性的菌株,经化学筛选方法确定植物内生真菌互交隔链孢霉ZHJG5作为后续研究目标。运用固定化FabH-HPLC联用亲和色谱筛选体系,从互交隔链孢霉ZHJG5次生代谢产物中筛选发现的三个对FabH具有抑制活性的天然产物alteractone(1),化合物 dehydroaltenusin(2),化合物 dihydroalterperylenol(4),其对 FabH 抑制中浓度(IC50)分别为 30.59±3.07μM,76.36±2.64μM,27.84±4.16μM。活性测试结果表明,化合物 1、2、4对水稻黄单胞菌的最小抑制浓度(MIC)分别为16μg/mL、8μ_g/mL、4μg/ml;在活体实验中,200μg/mL时,化合物1和2分别在对水稻白叶枯病具有46%和42%的防效,优于阳性对照硫酸链霉素。第四,针对化合物1,通过生物膜干涉技术、等温滴定量热法、分子模拟对接等手段我们研究了化合物1与FabH蛋白之间的相互作用,阐明与蛋白之间的作用方式。以上研究结果表明,我们以水稻黄单胞菌FabH为靶标,利用固定化酶HPLC联用技术,建立一套快速、高效的活性化合物筛选体系,并成功发现对水稻白叶枯病菌具有抑制作用小分子化合物,为创制拥有自主知识产权的新型高效、低毒、选择性好的绿色农药提供先导化合物。