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铁皮石斛(Dendrobium of cinale)为兰科石斛属多年生草本药用植物,能滋阴清热、生津益胃,主治热病津伤、口干烦渴、胃阴不足等病证;现代药理学研究表明能提高人体的免疫力,在抗衰老、抗肿瘤、降血糖等方面作用效果突出。因其广泛的药用价值受到了各研究学者的关注,对此开展了大量以铁皮石斛为材料的分子生物学研究,从分子水平研究铁皮石斛生理生化活动及分子机理解析,尤其在基因克隆及功能分析方面发展迅速。Obg蛋白质是一类广泛存在原核生物到真核生物的小G蛋白(三磷酸鸟苷结合蛋白),是生物体内重要的发育蛋白,在生命过程中Obg蛋白功能是不可会缺的。细菌研究中发现该蛋白在核糖体组装、孢子形成、DNA复制以及压力反应等方面发挥重要作用;因其功能重要性研究重点逐渐由细菌转向植物,在植物发现ObgC调节着核糖体形成、叶绿体发育、胚胎发育以及压力反应等生命活动,但仍有很多功能亟待挖掘和解析。本文以铁皮石斛为研究对象,采用基因克隆的方法,克隆铁皮石斛DoObgC基因全长cDNA序列,进行生物信息学分析及相关分子生物学研究,初步阐明了铁皮石斛DoObgC基因结构和蛋白功能。主要研究结果如下:1.通过对铁皮石斛基因组数据生物信息学分析,分析基因结构并设计引物,克隆铁皮石斛DoObgC基因全长cDNA序列1993 bp,开放阅读框为1872 bp,5’-UTR和3’-UTR碱基数分别为6 bp和115 bp,编码623个氨基酸,预测蛋白质分子量为67.62 kDa,理论等电点5.29,为亲水性不稳定蛋白。二级结构分析表明,包括α-螺旋、延伸链、β-转角以及无规卷曲。二硫键分析在Cys3-471、Cys10-163和Cys402-571可能存在二硫键。DoObgC蛋白质系统进化树分析显示,ObgC氨基酸序列具有较高保守性,DoObgC与油棕、小果野蕉最接近。2.利用 Gateway 技术,最终构建 pMDC83-DoObgC、pEarlyGate101-DoObgC 两个表达载体。利用农杆菌介导烟草瞬时表达,荧光共聚焦观察DoObgC-GFP/YFP融合蛋白均以颗粒状形式存在于叶绿体自发红色荧光内,DoObgC亚细胞定位于叶绿体。利用以上两种载体同转拟南芥obg-t突变体,T2代野生型、杂合体和纯合体植株分别为48、80、47株,符合孟德尔分离定律,47株纯合突变体能正常胚胎发育,表明DoObgC在拟南芥胚胎发育过程中能替代AtObgC完成胚胎发育功能。3.铁皮石斛DoObgCΔ(1-160)蛋白原核表达分析,在BL21和BL21(DE3)两种细胞中,在1mM IPTG、30 ℃诱导5h都能表达出大量目的蛋白,DoObgCΔ1-160)蛋白表达分析为50kD。在25μg/mL链霉素处理下,BL21(GST-DoObgCΔ(1-160))细胞存活率显著高于BL21(GST)细胞,表明DoObgCΔ(1-160)能提高对链霉素的生存力;DoObgCΔ(1-160)和链霉素37 ℃共培养,在0～8h内链霉素不能抑制DoObgCΔ(1-160)表达细胞生长,但在8 h后有无DoObgCΔ(1-160)表达细胞生长趋近一致,表明DoObgCΔ(1-160)能一定程度抵御链霉素压力,维持细胞短暂正常生长。4.实时荧光定量分析结果显示,DoObgC基因在铁皮石斛愈伤组织、白根、绿根、茎、新芽叶、叶、花和全株等组织中均有表达,结果表明在叶中的表达量最高,其次是叶、全株、花、茎、白根和绿根。割伤诱导表达发现,0～3 h内表达量逐渐降低,3 h达到最低,为正常时53%,然后表达量上升,6 h表达与平常时持平,12 h超过正常水平,表明DoObgC基因响应铁皮石斛(p)ppGpp压力信号转导。在黑暗和光照不同处理条件下,光照DoObgC基因表达量显著高于黑暗,表明DoObgC基因表达受光照诱导。