ADAMTS9经RNF180-DNMT3上调抑制胃癌淋巴结转移

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目的含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶9(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9,ADAMTS9)是含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)中的一员,近年来发现其可能在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用,影响患者的预后。本研究旨在探讨ADAMTS9否能作为胃癌淋巴结转移的有效标志物,以及评估胃癌患者预后。通过进一步的分子实验探索ADAMTS9发挥其生物学功能的上游及下游调控机制。方法1、16例患者胃癌组织及癌旁非肿瘤组织,提取组织RNA,采用半定量PCR(Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain react,Sq RT-PCR)方法检测组织中的表达水平,采集患者的临床资料,进行二者的相关分析;2、150例患者的胃癌组织及癌旁非肿瘤组织,制作组织芯片,应用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法检测ADAMTS9在组织中的表达水平,组织学评分(H-score)量化其表达水平。随后采集患者临床资料,进行ADAMTS9表达水平与临床资料的相关分析。随访患者预后信息,进行生存分析。3、通过胃癌细胞过表达ADAMTS9,探索ADAMTS9在胃癌细胞中的生物学功能。进行裸鼠皮下成瘤实验,探索ADAMTS9于体内对胃癌细胞的生物学功能。4、采用全基因组m RNA测序分析(Genome-wide m RNA sequencing analysis)探索ADAMTS9抑制胃癌细胞迁移和侵袭潜在的信号通路。并通过Real-time PCR、Western Blot及IHC的方法验证下游通路。5、胃癌细胞分别进行5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza)孵育,下调DNMT1(DNA methyltransferase1,DNMT1),DNMT3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)及DNMT3B(DNA methyltransferase3B,DNMT3B)处理,采用Sq RT-PCR及Western Blot的方法检测ADAMTS9的表达水平,验证ADAMTS9的甲基化调控通路。采用Mass ARRAY分析检测胃癌细胞不同处理的甲基化水平6、通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析及组织芯片免疫组化染色,检测RNF180与ADAMTS9之间的潜在相关性。通过胃癌细胞过表达RNF180后,采用PCR及Western Blot方法检测ADAMTS9的表达水平,并通过Mass ARRAY法检测ADAMTS9启动子甲基化程度,进一步明确RNF180调控ADAMTS9的潜在作用机制。随后通过放线菌酮及蛋白酶体抑制剂(MG132)的孵育,以及Western Blot及Co-IP(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)等检测方法,验证RNF180调控ADAMTS9的泛素化机制通路及相互作用蛋白。结果1、9/16例患者胃癌组织显示,ADAMTS9 m RNA表达水平显著低于癌旁非肿瘤组织,ADAMTS9 m RNA的表达水平与患者的p N分期(P=0.044)及淋巴结转移数目(P=0.024)显著相关性。2、组织芯片IHC结果显示,胃癌组织的ADAMTS9蛋白表达水平显著低于癌旁非肿瘤组织(P=0.008),ADAMTS9蛋白表达水平与患者的p N分期(P=0.018)及淋巴结转移数目(P=0.007)密切相关。且生存分析显示,ADAMTS9表达情况是评估患者预后的重要因素(多因素分析P=0.022),且AIC(Akaike information criterion,AIC)=71.55,BIC(Bayesian Information Criterion,BIC)=88.714,均为最小值。3、细胞功能学实验显示,ADAMTS9可以显著抑制胃癌细胞系AGS及BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力。裸鼠体内皮下成瘤实验显示,ADAMTS9可以抑制体内胃癌细胞BGC-823的增殖能力。4、全基因组m RNA测序,通过KEGG分析显示,ADAMTS9可能通过CCL5/CXCL11依赖性通路抑制胃癌淋巴结转移。通过Real-time PCR及Western Blot方法验证,ADAMTS9在多个胃癌细胞系中可以显著下调CCL5/CXCL11的表达水平。组织芯片的免疫组化结果显示,ADAMTS9表达水平与CCL5表达水平(Pearson r=-0.308,P=0.001),及CXCL11(Pearson r=-0.501,P<0.001)表达水平呈显著负相关。5、Sq RT-PCR和Western Blot实验显示,ADAMTS9启动子在胃癌中高度甲基化。ADAMTS9启动子甲基化水平主要受到DNMT1及DNMT3A调节,其中DNMT3A调控效果为佳。6、经过GEPIA在线数据分析及胃癌组织免疫组化结果分析显示,RNF180与ADAMTS9表达水平之间存在显著相关性。胃癌细胞过表达RNF180,进一步证实了,RNF180可能下调了ADAMTS9的启动子甲基化水平,从而上调ADAMTS9在细胞中的表达水平。进一步的机制研究,胃癌细胞经过放线菌酮(cycloheximide,CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理后,Western Blot结果显示,RNF180通过泛素化途径降解DNMT3A,降低其在胃癌细胞中的稳定性。Co-IP实验显示RNF180结合DNMT3A,提高了DNMT3A在胃癌中的泛素化水平。结论1、ADAMTS9在胃癌组织中低表达,其表达水平与p N分期及淋巴结转移数目密切相关,ADAMTS9低表达组患者显示了更差的预后。ADAMTS9可能作为评估患者淋巴结转移及评估患者预后的分子标志物。2、ADAMTS9显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、ADAMTS9可能通过显著下调CCL5/CXCL11表达水平,从而抑制胃癌淋巴结转移。4、ADAMTS9启动子甲基化受到DNMT1及DNMT3A调控,以DNMT3A为甚。5、RNF180与DNMT3A直接相互作用,增强DNMT3A的泛素化降解,从而上调ADAMTS9的表达水平。
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