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研究背景:再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA,简称再障)发病机理较为复杂,近年研究认为与造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)内在增殖或分化缺陷,造血微循环系统异常及机体免疫功能紊乱有关,三种机制在不同个体单独或联合作用,导致造血功能衰竭。目前认为,AA是一种以造血系统为靶目标的自身免疫性疾病,其中T细胞的功能异常发挥着关键作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓基质的一类具有自我更新能力和具有免疫调节作用的干细胞,许多临床研究报告指出,MSC可以治疗一些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、硬皮病,移植物抗宿主病(GVHD)等。目前研究发现MSC调节免疫反应的可能机制为:MSC具有独特的免疫表型,不表达MHCII分子和FasL,不表达或极低表达MHCI分子,不表达共刺激分子B7-1,B7-2,CD40,CD40L,因此它具低免疫原性,很难被免疫系统识别。体外实验表明,MSC能抑制T细胞在混合淋巴细胞培养或有丝分裂刺激下的增殖。而在细胞免疫应答时,环境中的可溶性外来抗原不能直接触发T细胞的免疫应答,是由抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)以特定的方式呈递给T细胞,而T细胞的激活和产生细胞因子与不同类型的APC相关。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知体内功能最强的专职性APC,能够在体内外直接刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖。MSC对AA患者T细胞增殖的影响国内仅见少量报道,而MSC是否通过调节DCs来影响AA患者T细胞的增殖,国内未见报道,其机制值得深入研究。研究目的:(1)研究MSC是否对AA患者的T细胞具有抑制增殖作用;(2)探讨MSC是否通过调节DCs的分化成熟来影响AA患者T细胞的增殖。研究内容:(1)将正常人骨髓的MSC与AA患者的T细胞共培养,流式细胞仪检测共培养前后的T细胞表面抗原和T细胞亚群的变化,以及免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ在培养前后表达的变化(ELISA法),研究MSC对AA患者的T细胞活化和增殖的影响。(2)从正常人外周血单个核细胞诱导DCs,将未成熟DCs在脂多糖(LPS)刺激下与正常人骨髓的MSC共培养,检测有或无MSC共培养前后,流式细胞仪检测DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达,研究MSC对DCs发育的影响。(3)将正常人外周血单个核细胞诱导DCs,在LPS的刺激下获成熟DCs后与正常人骨髓的MSC与共培养,DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达(流式细胞仪),研究MSC对成熟DCs的影响。研究方法:(l)体外分离培养正常人的MSC,观察细胞形态,同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原CDl05,CD29,CD34,CD44,HLA-DR。(2)提取20例再障患者(未经抗胸腺球蛋白等免疫治疗)的外周血单个核细胞,用T淋巴细胞尼龙毛柱分离法提取T淋巴细胞。用流式细胞仪进行T细胞表面抗原和T细胞亚群的检测鉴定。(3)取健康人外周血,分离单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和重组人白介素-4(IL-4)的培养条件下制备DCs。在LPS诱导下获得成熟树突细胞,用流式细胞仪进行DCs成熟前后的表型鉴定。(4)用正常人骨髓MSC与再障患者来源的T细胞共培养,流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,以及与免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4、IFN-γ、IL-10的蛋白水平在共培养前后的表达(ELISA法)。(5)从正常人外周血单个核细胞诱导DCs,将未成熟DCs在LPS刺激下与正常人骨髓的MSC共培养,流式细胞仪检测有或无MSC共培养前后,DCs表面抗原CD1a、共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达。(6)将正常人外周血单个核细胞诱导DCs,在LPS的刺激下获成熟DCs后与正常人骨髓的MSC与共培养,在显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DCs表面抗原CD1a和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达。研究结果:(1)正常骨髓间充质干细胞与AA外周血T淋巴细胞共培养后,流式细胞仪检测T细胞的CD8+细胞比例由(38.65士1.89)%下降为(29.69士1.62)%,CD4+细胞比例由(24.89士1.35)%上升至(34.89士1.89)%,差异具有统计学意义(P<0.05);ELISA检测IL-2蛋白水平由(38.89士4.36)?ng/L下降为(6.8士2.12)ng/L;IFN-γ由(38.46士1.64)ng/L下降为(6.62士1.78)ng/L;IL-4由(2.8士0.86)?ng/L上升为(5.32士1.68)ng/L;IL-10由(2.87士1.12)ng/L上升至(8.28士1.42)ng/L,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)未成熟的DCs在LPS的刺激下诱导后,流式细胞仪检测正常诱导组DCs细胞表面CD1a的表达升高,由诱导前的(2.4士1.2)%上调至(68.4士12.3)%,而CD14+的表达由诱导前的(83.6士1.4)%下调至(3.5士1.2)% ,CD83由(58.7士3.6)%上调至(72.4士10.6)%,CD80由(41.2士3.8)%上调至(50.6士6.2)%;而与MSC共培养组, CD1a表达率为(4.4士1.5)%,CD14+的表达仍保持较高的水平为(82.3士1.6)%,CD83表达为(60.8士12.2)%,CD80表达为(42.2士2.4)%,与LPS诱导前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)成熟DCs与MSC共培养后,CD14+由(5.8士2.0)%上调至(62.8士1.6)%,CD1a的表达率(48.6士4.2)%下调至(30.7士7.8)%,CD83由(60.8士12.2)%下调至(40.9士6.2)%,CD80由(50.2士4.8)%下调至(20.3士2.6)%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:MSC通过对CD8+和CD4+细胞的调节,抑制再障患者T淋巴细胞的增殖,进一步实验证明MSC能够抑制DCs的发育,逆转成熟DCs为未成熟DCs状态,提示MSC抑制AA患者T细胞增殖的可能机制是:MSC通过调控DCs的发育和成熟而下调了T细胞的活性,抑制其增殖,为MSC临床应用于治疗AA奠定一定的理论基础。