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目的：探讨GDNF促脊髓运动神经元存活和发育的PLCγ信号机制材料和方法：取胎龄14-15d的SD大鼠，分离出脊髓腹侧组织，经0.05％胰酶和终浓度为0.02％的EDTA37℃消化10min后吹打，经6.8％甲泛葡胺分离液密度梯度离心，收集位于甲泛葡胺和培养液之间的大细胞层，后经4％牛血清白蛋白除去细胞碎片，用完全培养基将试管底部的细胞重悬，种植在预先涂有多聚赖氨酸和层粘连蛋白的培养板或盖玻片上。
培养3d后用星型胶质细胞特异性标记物GFAP鉴定星型胶质细胞，神经元特异性标记物NSE单克隆抗体鉴定脊髓神经元；运动神经元特异性标记物SMI-32、p75NTR单克隆抗体鉴定培养的运动神经元。培养6d后成熟运动神经元标记物ChAT单克隆抗体鉴定培养的成熟运动神经元。
首先观察细胞密度对细胞存活率的影响，计算各细胞密度组(1.5×104、3.0×104、4.5×104、6.0×104、7.5×104cell/cm2)培养24h后的细胞存活率。
观察GDNF对培养细胞的量效关系。培养24h后观察对照组及不同GDNF浓度组(0.1、1、10、100ng/mL)的细胞存活率。
将培养的细胞分3个组：GDNF+U73122、GDNF+DMSO、GDNF组。GDNF浓度为以上试验得出的理想浓度，根据相关文献报道以及我们的预试验选择U73122浓度为2.5μmol/L，分别观察培养24h后的细胞存活率。
每组各设三个复孔，在200×的倒置显微镜下，选择96孔板的中央区域为计数范围，计数种植后4h的细胞总数，所有带光晕，胞内无空泡的细胞均计算在内，记此时的细胞存活率为100％。计算培养24h后的细胞存活率，所有有光晕、并且突起长度大于两倍胞体的细胞，胞体中无颗粒状态良好者均计算在内，共做三个批次。
细胞存活率用(_x)±s表示，用SPSS11.0统计软件包进行方差分析，p＜0.05为具有统计学意义。
结果：培养3d后脊髓腹侧细胞经免疫组织化学鉴定为NSE、SMI-32、p75NTR阳性细胞，少数为GFAP阳性细胞；培养6d的脊髓腹侧细胞免疫组织化学鉴定为ChAT阳性神经元。
当细胞密度为1.5×104、3×104、4.5×104、6×104、7.5×104cell/cm2时，细胞存活率分别为：27.67％±4.25％；36.87％±1.02％；40.97％±3.86％；46.11％±2.73％；46.61％±3.38％。1.5×104cell/cm2组的细胞存活率低于其余各组(3×104、4.5×104、6×104、7.5×104cell/cm2)的细胞存活率，t值分别为9.2033、13.3000、18.4677、18.9367，p值均小于0.01；3×104cell/cm2密度组细胞存活率低于6×104、7.5×104cell/cm2组，t值分别为9.2433、9.7333，p值均小于0.01；其余各组间差异无显著意义，p值均大于0.05。因而我们可以看出两个高密度组(6×104、7.5×104cell/cm2)的细胞存活率较高，由于细胞密度为7.5×104cell/cm2时，细胞间容易聚集成团，不利于细胞计数以及对细胞的观察，因而我们选择6×104cell/cm2作为GDNF量效实验的基础。
对照组及各GDNF浓度组(0、0.1、1、10、100ng/mL)的细胞存活率分别为：46.12％±2.73％；67.35％±1.77％；75.15％±2.80％；83.19％±1.07％；81.88％±2.12％。GDNF各浓度组(0.1、1、10、100ng/mL)的细胞率均高于对照组，t值分别为21.2300、29.0367、37.0733、35.7667，p值均小于0.01。0.1ng/mL组的细胞存活率低于其余GDNF浓度组(1、10、100ng/mL)，t值分别为7.8067、15.8433、14.5367，p值均小于0.01；1ng/ml组的细胞存活率低于10、100ng/mLGDNF组的细胞存活率，t值分别为8.0367、6.7300，p值均小于0.01。而10ng/mL与100ng/mL组的细胞存活率差异无统计学意义，t=1.3067，p=0.483。因而我们选择10ng/mL为促运动神经元存活的浓度，进一步观察U73122的干预作用。
GDNF+U73122，GDNF+DMSO及GDNF组细胞存活率分别为：31.87％±2.17％；79.39％±1.22％；81.38％±1.13％。GDNF+U73122组的细胞存活率均低于GDNF+DMSO组及GDNF组，t值分别为47.5200、49.5067，p均小于0.01。而GDNF+DMSO组与GDNF组的细胞存活率差异无显著性，t=1.9867，p=0.174。
结论：各GDNF浓度均可以促进胚胎脊髓运动神经元的存活和生长，10ng/mL是理想的促脊髓运动神经元存活浓度；U73122抑制GDNF促胚胎脊髓运动神经元存活的作用，提示PLCγ信号转导途径可能是GDNF促脊髓运动神经元存活的信号通路之一；本试验成功建立体外培养脊髓运动神经元的模型，培养时选择胎龄14-15d的大鼠、联合多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被底物有助脊髓运动神经元的成功培养。