目的:1归纳并探索抗精子抗体阳性大鼠模型建立的方法,为抗精子抗体相关大鼠试验研究积累数据及经验方法;2考察血清抗精子抗体和精液抗精子抗体对精子凋亡影响的差异,应用Annexin V/PI染色联合流式细胞仪分析抗精子抗体与精子凋亡的关系,为免疫性不育的病因研究积累资;3应用JC-1染色联合流式细胞仪、电镜、western blot以及分光光度法分析凋亡精子中线粒体跨膜电位和超微结构、细胞色素c的释放以及caspase-3活性的变化,为抗精子抗体致精子凋亡的途径研究提供证据。方法:1建立抗精子抗体阳性SD大鼠动物模型:取雄性SD大鼠40只,动物等级SPF,体质量200～230g,恒温条件下饲养,自由进水、进食。将大鼠随机分为2组:实验组30只、对照组10只。采用同种精子及福氏免疫佐剂对实验组大鼠进行免疫。对照组注射生理盐水。每隔7日重复。建模周期为21～35天。2采用电射精技术取大鼠精液:自备电射精仪。管状鼠笼固定大鼠,剪去背上腰部至骼部区域的毛,生理盐水擦净并润湿皮肤。将3×3cm的铜片电极固定在剪毛区域,接电射精仪的辅助电极。杆状电极轻轻插入大鼠肛门内约至2～3cm,接电射精仪的刺激电极。接通电源。每只大鼠平均刺激3至7次就可射精。3 ELISA法检测两组大鼠血清、精液抗精子抗体:采集大鼠精液及眼眶血标本后按照elisa试剂盒说明书步骤进行。血清、精液抗精子抗体俱为阳性证明局部模型建立成功,为精液组。血清抗精子抗体阳性证明循环模型建立成功,为血清组。4 Annexin V/PI染色结合流式细胞技术检测三组大鼠精子的凋亡率。制备三组大鼠精子标后,将精子标本用精子孵育缓冲液制成(3～6)×106个/ml的悬液,取195ul精子悬液,加入5ul Annexin V(0.2mg/ml)染液。室温避光孵育10min,离心(200×g,5min),PBS重悬洗涤3次后再次重悬于190ul PBS。加入PI(0.1mg/ml)染液10ul。室温避光孵育20min后,上流式细胞仪检测。激发波长488nm,分别以红色荧光和绿色荧光检测细胞。每份精子悬液标本获取10000个细胞。经CellQuest软件分析得正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡细胞所占的比例。5 JC-1单标法流式细胞术检测三组大鼠精子线粒体膜电位变化。将精液标本用PBS洗涤2次后离心。PBS重悬并调整精子密度为1×106/ml。加入终浓度为5μg/ml的JC-1,37℃恒温箱避光温育10min,PBS洗涤除去游离的多余染料后,PBS重悬,即刻上流式细胞仪检测。激发波长488nm,应用前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设门后,通过荧光通道FL1(绿)和FL2(红)检测荧光强度,每份精子悬液标本获取10 000个细胞。应用CellQuest软件获取和分析数据,用发橙红色荧光精子百分率表示MMP正常精子的比例。6 Western blot检测三组大鼠精子内细胞色素c的释放:精子标本于玻璃匀浆器中冰浴匀浆,采取分级差速离心法将细胞核与线粒体逐级分离出来,收集为胞质蛋白样品和线粒体蛋白样品。分别测定蛋白含量后加入上样缓冲液,加热变性,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,裁胶,半干转膜法转膜,封闭。分别加一抗或内参抗体,孵育过夜。加相应辣根过氧化物酶标记的二抗,孵育1h,ECL检测,拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度值分析。7分光光度法检测caspase-3活性:收集三组大鼠精子后按试剂盒说明书步骤进行caspase-3活性分析,酶标仪读数。8透射电镜观察实验组大鼠精子线粒体超微结构变化。取大鼠精子标本后,离心,固定。交电镜室处理切片后,透射电镜下观察线粒体超微结构。9光学显微镜下观察三组大鼠附睾内组织结构变化。取三组大鼠附睾,交病理科处理切片后,于光学显微镜下观察其组织结构。10统计学分析方法:所有统计学分析都应用SAS统计软件。40只SD大鼠分为精液组、血清组、对照组,对其精子凋亡率、精子线粒体跨膜电位、caspase-3活性值、细胞色素c蛋白灰度值分别行统计学分析,分别采用卡方分析和单因素方差分析,计量资料用(x±s),组间比较用S-N-K法和LSD法。结果:1抗精子抗体检测结果。按照试剂盒所定标准,抗精子抗体值高于60U/ml为阳性。实验组30只SD大鼠均为血清抗精子抗体阳性,抗体值为(79.8±7.1)U/ml,其中12只为血清、精液抗精子抗体阳性,精液抗体值为(76.7±6.6)U/ml,血清抗体值为(81.5±7.7)U/ml,剩余18只为精液抗精子抗体阴性,血清抗精子抗体阳性,抗体值为(78.1±7.5)U/ml。对照组为阴性。2 Annexin V/PI染色结合流式细胞技术检测凋亡结果。精液组、血清组和对照组精子凋亡率分别为(35.88±6.49)%、(14.30±2.30)%和(12.38±2.56)%。其中血清组与对照组凋亡率组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。精液组与对照组凋亡率组间比较,差异有统计学意义(P<0.001)。精液组与血清组凋亡率组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。3 JC-1单标法流式细胞术检测精子线粒体跨膜电位结果。精液组发橙红色荧光精子百分率为(40.25±9.50)%,血清组为(80.87±14.15)%,对照组为(81.56±12.78)%。其中精液组与对照组组间差异有统计学意义(P<0.001);精液组与血清组组间差异有统计学意义(P<0.001);血清组与对照组组间差异无统计学意义(P>0.05)。4 Western blot检测线粒体细胞色素c的释放结果。胞浆细胞色素c与内参灰度比值:精液组与血清组、精液组与对照组差异有统计学意义(P<0.05);血清组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。线粒体细胞色素c与内参灰度比值:精液组与血清组、精液组与对照组差异有统计学意义(P<0.05);血清组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。说明在AsAb作用下精液组精子线粒体内的细胞色素c发生了位置转移,从线粒体释放到了胞浆中。血清AsAb则对细胞色素c的释放没有影响。5分光光度法检测精子内caspase-3活性的结果:精液组与血清组差异有统计学意义(P<0.05);精液组与对照组差异有统计学意义(P<0.05);血清组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。说明AsAb作用于精子可导致精子Caspase 3活性的上升,但血清AsAb则无影响。6透射电镜观察线粒体超微结构结果。精液组精子线粒体大小不一,分布不均,有明显的肿胀,部分出现畸形或巨型线粒体,呈空泡状,线粒体嵴模糊甚至缺失。血清及对照组超微结构正常。7光学显微镜下观察三组大鼠附睾组织结构可见精液组大鼠附睾,上皮细胞增生,间质细胞水肿,管腔狭窄,且管腔内精子数量明显减少。血清及对照组正常。结论:1本实验采用的同种异体精子加福氏免疫佐剂对大鼠进行免疫的建模方法成功率高,周期短,且可建立精液抗精子抗体阳性模型,可为建立抗精子抗体大鼠模型的简便可靠方法。2精液抗精子抗体可诱导精子凋亡,血清抗精子抗体对精子凋亡无影响,可为抗精子抗体介导的免疫性不育病因研究提供重要参考。3精液抗精子抗体可导致精子线粒体跨膜电位下降、线粒体细胞色素c释放、caspase-3活性上升、线粒体超微结构发生病理改变以及附睾组织病理改变,可为抗精子抗体诱导精子凋亡的线粒体途径研究提供重要证据。