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PTX3是PTX蛋白家族的成员,作为卵丘细胞-卵母细胞复合体扩张的标志基因在排卵中发挥重要作用。然而,PTX3在奶山羊卵巢颗粒细胞中的表达、功能和调控机理尚不清楚。因此,本研究以体外培养的关中奶山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,分析PTX3在有腔卵泡生长发育过程中的表达规律,探究FSH、LH和miRNA对奶山羊卵巢颗粒细胞中PTX3基因表达,以及通过PTX3基因对颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇生成的分子调控机制,研究PTX3在卵泡生长发育过程中的生物功能,获得主要研究结果如下:1.PTX3对奶山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇生成的调控作用通过Real-time PCR分析发现PTX3 m RNA在奶山羊各组织中存在差异性广泛表达,其中在卵巢组织中表达量最高;Western Blot分析发现PTX3蛋白在颗粒细胞中的表达量随着有腔卵泡的生长呈下降趋势;CCK8、Ed U和流式细胞术分析发现PTX3抑制颗粒细胞活力和增殖,促进凋亡;ELISA和Western Blot分析发现PTX3通过促进颗粒细胞中类固醇合成关键酶CYP19A1和CYP11A1,而不改变HSD3B和STAR蛋白的表达从而升高E2和P4的分泌水平。2.miR-29靶向PTX3对奶山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇生成的调控作用通过生物信息学分析,构建双荧光素酶野生型和突变型报告载体,利用Real-time PCR和Western Blot分析证明miR-29能够靶向结合PTX3的3’UTR降低PTX3 m RNA和蛋白的表达水平;Real-time PCR分析发现miR-29在颗粒细胞中的表达量随着有腔卵泡的生长呈上升趋势;CCK8、Ed U和流式细胞术分析发现miR-29通过靶向PTX3促进颗粒细胞活力和增殖,抑制凋亡;ELISA和Western Blot分析发现miR-29通过靶向PTX3抑制颗粒细胞中类固醇合成关键酶CYP19A1和CYP11A1,而不改变HSD3B和STAR蛋白的表达从而降低E2和P4的分泌水平。3.miR-29-3p靶向PTX3调控奶山羊卵巢颗粒细胞功能的作用机理利用Western Blot分析发现miR-29靶向PTX3激活PI3K/AKT/m TOR和Erk1/2信号通路;通过PI3K/AKT/m TOR和Erk1/2信号通路抑制剂处理颗粒细胞,CCK8、Ed U、流式细胞术和ELISA分析发现抑制PI3K/AKT/m TOR和Erk1/2信号通路的活性能抵消miR-29和PTX3对颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇生成的影响;Western Blot分析发现Erk1/2信号通路通过调控CYP19A1、CYP11A1、HSD3B和STAR的蛋白表达,降低奶山羊颗粒细胞E2和P4分泌水平,而PI3K/AKT/m TOR信号通路通过调控CYP19A1、CYP11A1、HSD3B和STAR的蛋白表达,降低E2水平,升高P4水平;CCK8、Ed U和流式细胞术分析发现PTX3能抑制FGF2的作用从而抑制颗粒细胞活力和增殖,促进凋亡;ELISA和Western Blot分析发现PTX3能抑制FGF2的作用从而促进颗粒细胞中类固醇合成关键酶CYP19A1和CYP11A1,而不改变HSD3B和STAR蛋白的表达进而促进E2和P4的分泌水平。4.PTX3对FSH/LH调控的奶山羊卵巢颗粒细胞类固醇生成的作用FSH处理奶山羊颗粒细胞,利用ELISA分析发现FSH抑制小有腔卵泡的颗粒细胞分泌的E2和P4水平,促进大有腔卵泡的颗粒细胞分泌的E2水平,抑制P4水平;LH处理奶山羊颗粒细胞,利用ELISA分析发现LH促进小有腔卵泡的颗粒细胞分泌的P4水平,大有腔卵泡的颗粒细胞分泌的E2和P4水平;FSH/LH共处理奶山羊颗粒细胞,利用ELISA分析发现FSH/LH抑制小有腔卵泡的颗粒细胞中的E2水平,促进大有腔卵泡的颗粒细胞的E2和P4水平;并且Western Blot分析发现LH和FSH通过调控大、小有腔卵泡的颗粒细胞中的CYP19A1、CYP11A1、STAR和HSD3B蛋白表达来调控E2和P4的分泌;Western Blot分析发现FSH抑制大、小有腔卵泡的颗粒细胞中的PTX3蛋白的表达,LH促进大、小有腔卵泡的颗粒细胞中的PTX3蛋白的表达,FSH/LH抑制小有腔卵泡的颗粒细胞中PTX3蛋白的表达,而促进大有腔卵泡的颗粒细胞中PTX3蛋白的表达,无论LH和FSH单独还是联合处理,PTX3都是通过调控大、小有腔卵泡的颗粒细胞中CYP19A1和CYP11A1蛋白的表达来参与调控E2和P4的分泌水平;PTX3抑制大、小有腔卵泡的颗粒细胞中FSHR的表达,但只促进大有腔卵泡的颗粒细胞中LHR的表达。综上所述,FSH、LH和miR-29能调控奶山羊卵巢颗粒细胞中PTX3的表达,PTX3也能通过调控FSHR和LHR的表达反向调控FSH和LH的作用,PTX3通过抑制FGF2的作用,抑制PI3K/AKT/m TOR和Erk1/2信号通路,从而调控奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡,调控类固醇合成关键酶CYP19A1和CYP11A1的表达进而作用于颗粒细胞类固醇生成。以上结果为进一步探究PTX3参与调控奶山羊卵泡生长发育过程的分子机理提供试验依据。