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研究背景和目的:miRNAs是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA,通过靶基因mRNA裂解或序列特异性翻译抑制来发挥重要作用,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学过程。目前很多研究结果揭示在许多肿瘤中存在着miRNAs的调控异常,从而影响着肿瘤的发生发展、转移和浸润。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常见的类型。CHOP方案是目前被证实的治疗DLBCL的最经典治疗方案,然而超过50%的患者仍会出现耐药或复发的现象。现研究发现miRNAs与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药性存在密切相关。miR-148b位于人染色体12q13.13上,在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多种肿瘤组织中普遍存在表达异常。多个研究表明,上调MiR-148b可以逆转非小细胞肺癌细胞株对顺铂的耐药性,而miR-148b的上调同样可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株对放疗的敏感性。然而,miR-148b在DLBCL耐药中的作用还没有得到研究。因此,本研究旨在研究miR-148b在DLBCL的耐药中的潜在作用和机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。实验方法:1.收集DLBCL患者的新鲜肿瘤组织,根据CHOP方案治疗反应情况分为CHOP敏感组和CHOP耐药组,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b表达情况。2.采用低浓度药物浓度递增的方法建立人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP,采用CCK-8方法比较不同浓度CHOP对CRL2631细胞和耐药株CRL2631/CHOP细胞的活性影响,以及采用Western blot方法检测MDR-1蛋白水平在CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的表达情况。3.收集CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的总RNA,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b的表达情况。4.根据生物信息学预测软件,寻找miR-148b潜在的靶基因。采用经典的双荧光素酶报告基因实验,将野生型/突变型Ezrin 3’ UTR荧光素酶报告载体和miR-148b inhibitor/miR-148b mimic共转染CRL2631细胞,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒,分别检测各组细胞荧光素酶和海肾荧光素酶信号,并以海肾荧光素酶活性作为对照,计算荧光素酶相对活性。5.分别将miR-148b inhibitor和miR-148b mimic转染CRL2631细胞后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Ezrin mRNA和蛋白的表达情况。6.通过实时荧光定量PCR和Western blot分别比较DLBCL患者CHOP敏感组与CHOP耐药组两组和CRL2631细胞与CRL2631/CHOP细胞两组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平,并分析DLBCL患者的Ezrin mRNA和miR-148b表达的相关性。7.分别将 miR-148b inhibitor、NC、si-Ezrin 和 si-control 转染至 CRL2631 细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631细胞的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。8.分别将 miR-148b mimic、pre-NC、pcDNA-Ezrin 和 pcDNA 转染至 CRL2631/CHOP细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631/CHOP的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。9.分别将agomir-148b与agomir-NC转染CRL2631/CHOP细胞,然后在裸鼠背部皮下接种成瘤,采用CHOP方案进行处理后观察比较两组皮下移植瘤生长情况;取下肿瘤组织,采用实时荧光定量PCR检测两组的miR-148b表达情况;采用实时荧光定量PCR和Western blot检测两组Ezrin的mRNA和蛋白表达情况。结果:1.诱导产生了人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP;相比较CRL2631细胞,CRL2631/CHOP细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显著提高。2.DLBCL患者CHOP敏感组肿瘤组织的miR-148b表达水平显著高于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的miR-148b表达水平显著低于CRL2631细胞。3.通过生物信息学软件(RAID v2.0)预测发现,Ezrin是miR-148b的直接靶基因。相对于对照组,miR-148b mimic+野生型Ezrin 3’UTR载体(WT)组荧光素酶活性明显降低,而miR-148bmimic+突变型Ezrin 3’UTR载体(MUT)组荧光素酶活性无明显改变。相反,在miR-148b inhibitor+WT组,荧光素酶活性与对照组显著提升,而miR-148b inhibitor+MUT组的荧光素酶活性改变与对照组比较并无显著差异。4.上调miR-148b的表达后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和Ezrin蛋白的表达量均较对照组显著下降。另外,与对照组相比,miR-148b的表达下调后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和蛋白表达量呈显著提升。5.DLBCL患者CHOP敏感组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平显著低于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显著高于CRL2631细胞;进一步发现,DLBCL患者中,miR-148b与Ezrin mRNA表达存在直线负性相关关系。6.miR-148b inhibitor转染CRL2631细胞后,Ezrin的蛋白表达上调,细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显著提高;共同转染miR-148b inhibitor 和 si-Ezrin 后,miR-148b inhibitor+si-Ezrin组 CRL2631 细胞的 Ezrin蛋白表达较miR-148b inhibitor组明显降低,细胞对CHOP敏感性显著提升,MDR-1蛋白水平表达下降。7.miR-148b mimic转染CRL2631/CHOP细胞后,Ezrin的蛋白表达下调,细胞对CHOP的敏感性增强,IC50值明显下降,MDR-1蛋白表达水平也显著下降;而共同转染 miR-148b mimic 和 PcDNA-Ezrin 后,miR-148b mimic+PcDNA-Ezrin 组CRL2631/CHOP细胞的Ezrin蛋白表达较miR-148b mimic组明显上调,细胞对CHOP敏感性显著下降,MDR-1蛋白水平表达明显上升。8.裸鼠在CHOP处理后,agomir-148b组皮下移植瘤体积较agomir-NC组显著减小;另外,而agomir-148b组的miR-148b表达水平显著高于agomir-NC组,而agomir-148b组的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显著低于agomir-NC组。结论:1.miR-148b在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现低表达。2.Ezrin在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现高表达3.Ezrin为miR-148b的靶基因4.miR-148b通过靶向调控Ezrin调节DLBCL细胞对CHOP的耐药性6.本研究结果有助于探索DLBCL细胞耐药性中的关键作用的分子及其调控机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。