弓形虫是非常重要的人兽共患寄生原虫,能感染人和几乎所有的温血动物并寄生于这些宿主的有核细胞中。复杂的寄生环境需要虫体灵活地调整自身代谢活动以充分摄取宿主细胞中的营养物质,这种适应性调控机制对虫体建立寄生生活至关重要,但对应的分子机制知之甚少。真核细胞中广泛存在由α催化亚基和β、γ调节亚基组成的AMPK复合物（AMP依赖的蛋白激酶）,是细胞中能量代谢稳态的关键调控分子。实验室前期已鉴定到弓形虫中存在一个AMPK复合物并分析了β与γ亚基的功能,本研究聚焦于Tg AMPKα亚基,采用遗传学与细胞生物学等手段分析其在虫体生长和代谢中的生物学作用与分子机制,具体的研究内容如下:1.Tg AMPKα在弓形虫速殖子生长和代谢调控中的生物学作用利用Di Cre系统构建了Tg AMPKα条件性缺失虫株,体外正常培养条件下发现缺失Tg AMPKα导致虫体不能被传代,也无法形成空斑,表明Tg AMPKα对弓形虫速殖子的生长至关重要。缺失Tg AMPKα造成虫体ATP水平与大多数糖酵解、TCA循环代谢流通量显著降低,提示Tg AMPKα与虫体的能量稳态紧密相关。进一步的磷酸化蛋白组学检测发现,缺失Tg AMPKα导致多个代谢相关酶在多个位点的磷酸化水平上升或下降,提示Tg AMPKα可能通过磷酸化代谢相关酶参与调节虫体的能量代谢。在哺乳动物中AMPK活性受到磷酸化的调控,其α催化亚基T172位点发生磷酸化可大幅提高其激酶活性,进而磷酸化下游底物发挥生物学功能。多序列比对发现:弓形虫Tg AMPKα的T221对应哺乳动物AMPKα的T172位点,并且使用可识别人AMPKαT172位点的磷酸化抗体能够成功检测到磷酸化的Tg AMPKα。用该抗体进行免疫印迹检测发现:宿主细胞内的虫体其Tg AMPKα磷酸化维持在很低的水平,当弓形虫逸出至胞外环境后,Tg AMPKαT221位点的磷酸化水平大幅提升。通过突变Tg AMPKα磷酸化位点模拟失活状态（T221A）和激活状态（T221D）发现:Tg AMPKα磷酸化位点失活（T221A）降低了弓形虫胞外运动能力,但它仍然能够支持虫体的生长,由此推测,当Tg AMPKα的蛋白水平较高时,T221位点的磷酸化对Tg AMPKα生物学功能不具有决定性影响,这与哺乳动物中的AMPK具有显著不同。为进一步探索Tg AMPKα的重要功能域,我们构建了一系列Tg AMPKα截短的突变体并将它们回补到Tg AMPKα条件性缺失虫株中,对这些突变虫株进行生长表型检测发现:AMPKα1-650可以救援缺失Tg AMPKα导致的弓形虫生长缺陷,但Tg AMPKα1-623或更短的突变体无法救援,表明除了激酶域等已知的功能域以外,624-650位点之间的氨基酸序列对Tg AMPKα的生物学功能也至关重要。2.磷酸果糖激酶的生物学功能与分子机制研究Tg AMPK不同亚基的缺失均可导致虫体多个代谢相关酶的磷酸化水平发生变化,其中包括糖酵解。虫体中大多数糖酵解酶具有两种亚型且呈时期差异性表达,但具体的生物学作用与机制尚不可知。为此,本研究聚焦Tg AMPK潜在的下游靶标——磷酸果糖激酶（PFK）进行研究。弓形虫编码两个PFK,通过酶活力检测发现PFK1是ATP依赖的磷酸果糖激酶（ATP-PFK1）,而PFK2是焦磷酸（PPi）依赖的磷酸果糖激酶（PPi-PFK2）。直接敲除PFK1后发现它对速殖子的生长作用不大,而利用mini AID条件性降解系统用吲哚乙酸（IAA）诱导PFK2降解发现它对弓形虫的生长至关重要。虽然PFK2的降解导致糖酵解和TCA循环标记的代谢物有轻微下降,但基本不影响虫体的ATP水平。另一方面,PFK2降解造成虫体焦磷酸水平的上升和新蛋白合成速率下降,并且回补能够水解焦磷酸的焦磷酸酶（PPase）可以缓解虫体焦磷酸的积累、增加新蛋白合成速率,从而部分救援PFK2降解导致的弓形虫生长缺陷,表明PFK2主要通过维持焦磷酸稳态来调节虫体合成和分解代谢的平衡,进而调控虫体的生长。综上所述,本研究发现Tg AMPKα催化亚基对弓形虫速殖子生长和代谢是至关重要的,通过磷酸化调节下游代谢酶活性进而调控虫体能量代谢。解析了PFK2通过调节虫体焦磷酸稳态来协调合成与分解代谢进程,使虫体高效的利用获得的营养物质。本研究对理解弓形虫寄生生活的分子基础具有重要理论参考价值,对开发弓形虫新型防控手段也具有指导意义。