核糖开关作为合成生物学研究中一类重要的核心元件,由配体结合区和表达调控区两部分组成,配体结合区通过与配体分子的结合而引起表达调控区域的结构变化,从而影响到表达调控区域下游基因的表达。天然存在的核糖开关在细菌细胞的代谢通路调控中起着重要的作用,诸如氨基酸的转运与结合、嘌呤碱基核苷酸的合成等,但由于其存在的数量及种类较少不能满足目前研究的需要,研究者们已开发出配体指数富集系统进化技术(SELEX),人工设计出可响应目的化合物的核糖开关,这大大扩展了核糖开关在合成生物学研究中的应用。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是一类最常见的唾液酸,同时也是合成其他多种唾液酸的重要前体物质,在自然界中广泛地存在。N-乙酰神经氨酸在许多生理和病理过程中发挥着重要的作用,在制药领域也有着很大的应用潜力,因此,它的合成与应用已经引起了科学研究者广泛的关注。我们实验室通过微生物代谢工程技术在大肠杆菌体内构建了一条N-乙酰神经氨酸的合成途径,并取得了很好的效果。但传统的代谢工程中,每一步的代谢改造,每一个代谢合成元件的替换,都需要发酵实验进行产量的验证,过程耗时耗力,且结果并不十分理想。如果将细胞内合成神经氨酸的量与可直接观察或易于检测的外向表征连系起来,就可以大大简化代谢改造的过程,缩短菌株进化的时间。本研究根据前人筛选获得的响应神经氨酸的核糖开关,设计了开关筛选组件,将神经氨酸的产量与细胞的生长相偶联。此核糖开关由可结合神经氨酸的适配子区和可进行自剪切的锤头型核酶两部分构成,适配子区通过与神经氨酸的结合而改变开关的构象引起核酶的自剪切,从而降低下游基因的mRNA的丰度。将下游基因设计为可影响细胞生长的报告基因,即可完成筛选组件的构建。参照文献报道利用重组PCR的方法合成了此神经氨酸核糖开关序列,并将其下游连上gfp绿色荧光蛋白报告基因,得到开关验证质粒pE-rsgfp,并将其转化入大肠杆菌DH5α中,通过外源添加神经氨酸的培养实验,发现随着神经氨酸添加量的增多,菌液的相对荧光强度减弱,验证了此核糖开关可以在大肠杆菌体内响应神经氨酸并抑制下游报告基因的表达。验证了神经氨酸核糖开关的体内活性后,本实验将下游的gfp替换为tetA四环素抗性基因,构建得到神经氨酸核糖开关筛选组件。tetA表达的TetA蛋白是一种结合在细菌细胞膜上的双向转运蛋白,可向胞外运出四环素,向胞内运入镍离子,而镍离子对细胞的生长有毒害作用。在培养基中添加一定浓度的镍离子的前提下,当细胞内存在神经氨酸时,神经氨酸会结合在核糖开关上抑制tetA的表达,那么TetA运入细胞内的镍离子较少,使得细胞获得较快的生长速率,通过多次转接多轮进化,就可使高产神经氨酸的细胞得到富集。将构建好的核糖开关筛选组件通过外源添加和内源合成神经氨酸两种方式验证了功能之后,将其构建在质粒p15A上,得到开关筛选组件质粒p15A-rstetA;将实验室保存的神经氨酸生产质粒pB上的四个基因neuB、slr1975、GNAg1、glmS的RBS区域随机化得到一个质粒突变库pBM,以期通过优化神经氨酸合成途径中关键基因的表达强度来提高神经氨酸的产量。将质粒库pBM转入已含有p15A-rstetA的神经氨酸生产菌株大肠杆菌DN5中,在添加有镍离子的进化培养基中开始进化过程,每轮转接三次,共进行三轮,最终筛选富集得到含有质粒库中相对高产神经氨酸质粒的大肠杆菌,证明了本论文所构建的NeuAc核糖开关筛选组件可响应胞内合成的N-乙酰神经氨酸并对下游基因进行调控,在合适的筛选培养基和镍离子浓度下,可对高产神经氨酸的菌体细胞进行富集。本实验成功地构建了可响应大肠杆菌胞内神经氨酸并调控下游基因表达的神经氨酸核糖开关筛选组件,并通过进化从产神经氨酸质粒突变库中富集得到高产质粒,为N-乙酰神经氨酸的微生物代谢改造生产提供了新的研究思路与策略。