生物冶金技术具有成本低、环境友好等传统冶金方法不能比拟的优势,在处理低品位矿石方面应用前景广阔,对我国的可持续发展具有重要意义。生物浸矿伴随着铜离子的不断溶出积累,对浸矿微生物有毒害作用,是影响冶金效率的重要因素之一。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌是生物冶金中的优势菌种,也是报道的耐受铜离子最强的浸矿微生物,是研究浸矿细菌铜抗性的绝佳材料。但是,该菌的铜离子抗性研究还不完善,仅有参照大肠杆菌的铜抗性机制、利用生物信息学和组学等推测构建的铜抗性模型,抗铜元件缺乏在细菌自身中的实验验证。因此,借助本实验室对该菌进行遗传操作的技术优势,深入研究模型中的铜抗性基因,既可丰富完善该菌的铜抗性机制,又为构建高效抗铜菌株提供理论依据和实验数据,不仅具有理论意义,也具有实用价值。在A.ferrooxidans的铜抗性机制模型中,已知主要有三个抗铜系统共同起作用维持细胞的铜离子平衡,分别是Cop系统、Cus系统和基于多聚磷酸物polyP的调节机制。Cop系统中的CopAl、CopA2、CopB是P-ATPase,其作用已经被实验室前期工作验证。CopD是Cop系统中一个定位在内膜上的蛋白,copD基因受铜离子刺激表达上调,但功能尚不清楚。为了研究该基因的功能,采用本实验室建立的无标记基因敲除方法对copD基因进行了敲除。首先根据A.ferrooxidans ATCC 23270基因组上的基因序列设计引物扩增基因的上游同源臂和下游同源臂,经测序后亚克隆至自杀质粒,构建敲除质粒pK19TG-copD;将敲除质粒采用接合转移方法导入宿主菌A.ferrooxidans ATCC 23270中,利用卡那霉素抗性筛选单交换子;利用重组质粒pMSD1-PTSceI编码的I-Sce I酶诱导单交换子发生第二次同源重组,通过筛选成功获得copD基因敲除突变株A.ferrooxidans ΔcopD,为研究copD基因在铜抗性中的功能提供了实验材料。在成功获得copD基因敲除突变株的基础上,以A.ferrooxidans ATCC 23270野生型作为对照,测定了分别以硫粉和亚铁为能源时,野生型和ΔcopD敲除突变株在不同铜离子浓度下的生长和亚铁氧化能力;测定了在不同能源下,WT和ΔcopD在铜离子刺激后铜抗性相关基因的表达差异。结果表明,以硫为能源时,与野生型相比,copD基因的敲除对菌株生长具有一定抑制作用,但低浓度铜离子对ΔcopD敲除突变株的生长具有促进作用,高浓度铜离子才抑制生长;以亚铁为能源时,copD基因的敲除提高了菌的亚铁氧化能力,结合基因表达差异分析,表明CopD可能与铜离子的吸收有关。基因过表达也是研究基因功能的有效手段。实验室前期的转录组学和qRT-PCR研究结果显示,Cus系统基因受铜离子刺激表达上调,很可能在A.ferrooxidans铜耐受性中起重要作用。选择Cus系统的cusCBA操纵子作为研究对象,利用pJRD215质粒和Ptac强启动子构建了cusCBA基因过表达菌株A.ferrooxidans(pJRD215-PTcusCBA)。分别测定了以硫和亚铁为能源时,cusCBA基因过表达工程菌在不同铜离子浓度下的生长曲线和亚铁氧化曲线,并检测了铜离子刺激下相关基因的差异表达。结果表明,cusCBA操纵子的过表达能显著提升A.ferrooxidans的铜耐受性。与野生型菌株相比,低浓度铜离子能促进cusCBA基因过表达菌株的生长,证明CusCBA在A.ferrooxidans铜抗性中具有重要作用。通过qRT-PCR从A.ferrooxidans ATCC 23270铜抗性相关基因中筛选了对其他重金属离子响应较低、对铜离子响应较高的5个基因,扩增基因的启动子片段,以gusA基因作为报告基因,构建重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α,通过检测不同转化子的GusA活性,比较了启动子的活性和受铜离子刺激的响应。结果显示在铜离子刺激后,cus操纵子的启动子响应最高,活性提高4～5倍,适合作为铜离子特异性诱导启动子深入研究,进一步探索用于构建A.ferrooxidans高效抗铜菌株和铜离子传感器的可行性。综上,本文通过构建A.ferrooxidans ΔcopD基因敲除突变株、测定敲除突变株的抗铜性质,发现CopD可能起吸收铜离子的作用。通过高效表达cusCBA基因显著提高了该菌的铜耐受性,为分析Cus抗铜系统的功能提供了材料,也为构建稳定的高效抗铜基因工程菌提供了借鉴。此外,还在大肠杆菌中利用gusA基因从A.ferrooxidans中筛选了一个对铜离子刺激响应高的启动子,可用于后续在A.ferrooxidans中进一步深入研究。