牙龈卟啉单胞菌是牙周病,尤其是慢性牙周炎病变区最主要的优势细菌,是目前公认的牙周病致病菌。其毒力因子主要包括外膜上的纤毛、脂多糖、外膜膜泡,多种胞外蛋白酶、内毒素、磷酸酶等。而酪氨酸蛋白酶(Tyrosine protein phosphatase,Ltp1)被鉴定为主要的毒力因子之一,但是其致病机制未知。目的:构建牙龈卟啉单胞菌中Ltp1基因的原核表达系统,表达和纯化目的蛋白Ltp1,同时对目的蛋白进行晶体学初筛,尝试优化蛋白晶体,并通过X射线晶体衍射的方法解析结构,基于结构阐明Ltp1的生物学功能和致病机理。材料与方法:直接合成Ltp1目的基因片段,然后通过重组法,将目的基因片段构建于带有组氨酸(His)标签的p ET29质粒载体上,转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导感受态过表达目的蛋白Ltp1,然后以镍柱亲和层析和分子筛对目的蛋白进行纯化,通过免疫印迹法分析鉴定其免疫原性;利用硝基苯磷酸盐(p-Nitrophenyl phosphate,p-NPP)底物对目的蛋白进行酶学检测。结果:1、成功构建出牙龈卟啉单胞菌Ltp1基因的原核表达载体,经IPTG诱导感受态过表达出分子量约为18.75 k Da的目的蛋白。2、所表达目的蛋白经免疫分析证实是带有His标签的目的蛋白。3、经p-NPP法检测目的蛋白为酪氨酸磷酸酶蛋白,且最适反应温度为37-50℃,最适反应p H为5.0-7.0。结论:成功构建出pg1641-p ET29-His原核表达系统,且能够在大肠杆菌中高效稳定表达;Western Blot结果证实,所表达Ltp1蛋白酶为酪氨酸磷酸酶,且最适反应温度和p H分别为37-50℃,5.0-7.0,为后续Ltp1蛋白的晶体学初筛和结构解析奠定基础。