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背景与目的:肝细胞核因子4a（Hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A）又称NR2A1,是一种属于核受体超家族成员的转录因子,其广泛表达于人体多器官中并参与了原始胚胎的形成及生长发育。近年来研究表明,HNF4A在肝细胞肝癌中作为抑癌基因参与了肿瘤的发生发展,但是在食管腺癌中却充当癌基因促进肿瘤的进展。然而,HNF4A在胃癌中的具体生物学作用及转录调控网络尚未明确。本研究拟通过生物信息学方法结合体外体内实验探讨HNF4A在胃癌中的致病机理与调控网络。方法:1.生物信息学分析利用R语言的“limma”包联合韦恩图分析TCGA-STAD及GSE78523数据集中的共同差异性转录因子。进一步,在GSE184336数据集、TIMER2及GEPIA2数据库中分析HNF4A在胃癌组织与正常组织中的表达差异。UALCAN数据库用来分析HNF4A表达量与病理分期及分级的相关性。KM plotter用来分析HNF4A表达水平与胃癌患者生存率的相关性。TISIDB数据库和R语言用来分析HNF4A是否参与胃癌免疫调节的过程。c Bio Portal数据库用来分析HNF4A在胃癌中的突变情况。GSEA 4.2软件及Metascape数据库用来分析HNF4A可能参与的生物学过程与富集的通路。2.临床样本分析（1）收集临床胃癌标本,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组织化学（IHC）染色分析HNF4A在胃癌与癌旁组织中的相对表达量;（2）依据HNF4A在胃癌样本中m RNA相对表达量的中位数,将胃癌患者分为两组,通过卡方检验分析HNF4A表达量与患者临床病理特征的相关性。3.HNF4A对胃癌细胞增值、迁移及侵袭的影响（1）在胃癌细胞系中敲低HNF4A的表达,通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）、平板克隆形成、细胞划痕及Transwell实验来探讨HNF4A对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;（2）通过敲低HNF4A在胃癌细胞系中的表达,利用Western blot实验分析增殖（PCNA）、周期（Cyclin D1、P21）、迁移相关蛋白（MMP2、MMP9）及PI3K/AKT通路相关蛋白的变化。4.HNF4A转录调控KIF2C机制探讨（1）GSEA软件用来对HNF4A进行hallmark通路富集分析,选择富集评分最高通路中的核心基因作为候选靶基因。GEPIA2数据库用来分析HNF4A与目的靶基因的相关系数;（2）在胃癌细胞中,利用免疫荧光共聚焦实验来探究HNF4A及KIF2C的细胞定位。在胃癌细胞系中敲低HNF4A的表达,利用qRT-PCR及Western blot实验分析KIF2C的m RNA及总蛋白变化情况。通过JASPAR数据库预测两者可能的结合位点,并通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验探究HNF4A对KIF2C启动子的调控。然后,通过双荧光素酶报告实验探究HNF4A调控KIF2C启动子的具体结合位点。5.KIF2C对胃癌细胞恶性生物学行为的影响（1）通过TCGA-STAD、GSE184336、GSE29272、GSE26899数据集分析靶基因KIF2C在胃癌与正常组织中的差异性表达。qRT-PCR、Western blot和IHC实验分析KIF2C在临床胃癌与癌旁组织样本中的相对表达量;（2）通过在胃癌细胞系中敲低或过表达KIF2C,探讨其对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。通过改变KIF2C在胃癌细胞系中的表达量,Western blot实验用来分析其对相关增殖、周期、迁移及PI3K/AKT通路蛋白的影响;（3）通过构建抗性为嘌呤霉素的sh-HNF4A质粒及抗性为新霉素的LvKIF2C病毒,然后在稳定敲低HNF4A胃癌细胞株的基础上过表达KIF2C,以此进行回复实验,进一步明确两者的作用关系;（4）在体内实验中,通过裸鼠皮下荷瘤实验及基因干预来探究HNF4AKIF2C信号轴对瘤体生长的影响,并对各组瘤体进行H＆E染色及IHC分析。结果:1.HNF4A在胃癌中的生物信息学分析在TCGA-STAD及GSE78523数据集中共得到了包含目的转录因子HNF4A在内的8个共同差异转录因子。表达量及预后分析表明,HNF4A在胃癌多数据集中呈现高表达,并且高表达HNF4A与患者总生存率较差存在相关性（P＜0.05）。免疫分析结果表明,HNF4A和免疫浸润细胞、免疫检查点相关基因及免疫调节剂之间存在相关性（P＜0.05）,HNF4A还与肿瘤突变负荷（r=0.28,P＜0.0001）、微卫星不稳定性（r=0.13,P＜0.01）相关。通路富集结果表明,HNF4A可能和器官的生长发育、多种代谢途径及细胞周期循环等生物学过程相关。2.HNF4A在胃癌组织中高表达并与临床病理特征相关（1）qRT-PCR、Western blot及IHC实验对临床胃癌样本分析表明,与正常组织相比,HNF4A在胃癌组织中的表达量增高,两者对比具有统计学意义（P＜0.05）;（2）临床病理资料分析表明,HNF4A表达量与T、N、Stage分期及Grade分级密切相关（P＜0.05）。3.HNF4A促进胃癌细胞增殖、迁移及侵袭（1）在CCK-8、Ed U、平板克隆形成实验中,与对照组相比,sh-HNF4A组胃癌细胞的增殖能力表现下降（P＜0.05）。在细胞划痕及Transwell实验中,与对照组相比,sh-HNF4A组胃癌细胞的迁移及侵袭能力减弱（P＜0.05）;（2）Western blot实验表明,与对照组相比,sh-HNF4A组的PCNA、Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达量降低,P21蛋白表达量升高（P＜0.01）;p-PI3K及p-AKT蛋白表达量下降（P＜0.01）,而PI3K和AKT蛋白无明显变化。4.HNF4A转录激活KIF2C（1）数据库分析表明,KIF2C可能是HNF4A一个全新的潜在下游靶基因,两者的相关性为中等强度（r=0.5）,并且HNF4A结合KIF2C启动子区域存在三个可能结合位点（Binding site,BS）;（2）qRT-PCR及Western blot实验表明,在胃癌细胞株中敲低HNF4A表达后,KIF2C的m RNA及总蛋白变化与HNF4A表达量呈正相关（P＜0.01）。在机制上,HNF4A及KIF2C共定位于细胞核中,HNF4A可以转录激活KIF2C,并且BS2（-1381～-1368）、BS3（-715～-700）是其结合的核心区域。5.KIF2C在胃癌组织中高表达并促进了胃癌细胞的恶性生物学行为（1）数据库及临床胃癌样本分析表明,与正常组织对比,KIF2C在胃癌组织中呈现高表达（P＜0.01）,并且KIF2C的表达量与Grade分级密切相关（P＜0.01）。GSEA富集分析结果表明,KIF2C在胃癌中主要通过介导细胞周期生物学过程影响疾病的进展;（2）在细胞功能实验中,与对照组相比,敲低KIF2C表达后,胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力表现出下降（P＜0.05）。Western blot实验表明,与对照组相比,sh-KIF2C组的PCNA、Cyclin D1、MMP2、MMP9、p-PI3K及p-AKT蛋白表达量降低,P21蛋白表达量升高（P＜0.01）。并且,在过表达KIF2C后,与对照组相比,上述相关胃癌细胞功能实验及相关蛋白变化则出现了相反的趋势（P＜0.05）;（3）在回复实验中,通过细胞功能实验表明,与sh-HNF4A组相比,shHNF4A+Lv-KIF2C组胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力得到部分逆转（P＜0.05）。Western blot实验表明,与sh-HNF4A组相比,sh-HNF4A+LvKIF2C组的增殖、周期及迁移相关蛋白表达量得到部分回复,并且p-PI3K及pAKT蛋白表达量也得到部分回复（P＜0.05）;（4）在体内实验中,HNF4A及KIF2C分别作为致癌基因促进了裸鼠的瘤体生长,并且敲低HNF4A表达后再次过表达KIF2C瘤体的生长得到部分逆转。瘤体IHC结果表明,与对照组相比,sh-HNF4A组KI67的表达量下降,而LvKIF2C组KI67的表达量增加（P＜0.05）。与sh-HNF4A组相比,sh-HNF4A+LvKIF2C组KI67的表达量得到部分回复（P＜0.05）。结论:1.HNF4A在胃癌生物信息学分析中呈现高表达并与预后相关,其可能参与了胃癌免疫调节生物学过程;2.HNF4A在胃癌组织样本中高表达,并作为癌基因促进了胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭;3.HNF4A在启动子BS2（-1381～-1368）及BS3（-715～-700）区域转录激活KIF2C,进而激活PI3K/AKT信号通路促进胃癌的进展。因此,HNF4A-KIF2C信号轴是一个潜在的治疗靶点;4.KIF2C在胃癌组织中表达量增高,并作为癌基因促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭,并且HNF4A促进胃癌细胞恶性生物学行为依赖于KIF2C的表达。