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CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的由sgRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因位点并进行编辑的技术,能够在复杂的基因组和RNA水平引入精细的改变或沉默,相较于之前的锌指核酸酶技术(Zinc finger nuclease, ZFN)和转录激活子类似的效应子核酸酶技术(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN),CRISPR/Cas9的设计和使用更加方便快捷,并且不需要对序列特殊地分析,也不需要对应地去寻找识别模块,其具有极大的应用优势。本研究针对牛肌肉抑制素基因(myostatin, MSTN)第二外显子的一段序列设计构建了CRISPR/Cas9A打靶载体,针对MSTN的第二外显子的另一段序列同时设计并构建了一组ZFNs和一个CRISPR/Cas9B打靶载体,然后使用电转染方法分别将ZFNs载体和Cas9载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,通过口吸管挑取单细胞并扩培,利用PCR和测序检测突变体的产生。结果显示,ZFNs转染所获得的74株细胞克隆中含有4株基因突变细胞系,敲除效率为5.12%；CRISPR/Cas9A转染的17株单克隆细胞中含有1株敲除细胞系,且为缺失8bp的双等位基因敲除细胞系,敲除效率为5.88%；CRISPR/Cas9B转染的77株单细胞克隆中有21个突变细胞系,敲除效率为27.05%,其中包括2株双等位基因敲除细胞系,分别为3bp插入突变和13bp缺失突变,双等位基因的敲除效率为9.52%。以上结果表明,针对第二外显子的打靶载体CRISPR/Cas9B的打靶效率高于CRISPR/Cas9A打靶载体,而针对同一位点的CRISPR/Cas9B的敲除效率约是ZFNs的敲除效率的5倍。进而为了检测ZFNs和CRISPR/Cas9B的外源整合效率,针对ZFNs和CRISPR/Cas9B靶向位点构建表达hfat-1和EGFP基因的质粒pflrkt和pGlrkt,在外源基因的5’端和3’端分别带有与靶向位点序列相同的885bp和823bp的同源臂。通过电转染的方法将ZFNs:pflrkt/pGlrkt和CRISPR/Cas9B:pflrkt/pGlrkt分别导入到牛胎儿成纤维细胞中,经过G418筛选、细胞单克隆制备和同源臂跨臂PCR检测,最终获得外源基因定点整合的细胞系。经过鉴定,在95株ZFNs介导的pGlrkt定点整合的细胞系中共获得13株打靶细胞,打靶效率为13.68%,未获得pflrkt定点整合细胞系；使用CRISPR/Cas9B介导的pflrkt载体定点整合的81株细胞系中获得64株打靶细胞,pGlrkt载体定点整合的119株细胞系中获得74株打靶细胞,其打靶效率分别为79.01%和57.84%。实验证明,CRISPR/Cas9介导的基因打靶效率明显高于ZFNs,约为ZFNs的5倍。本研究最终共获得26株MSTN敲除的牛胎儿成纤维细胞系和64株hfat-1定点整合细胞系,这些细胞为后续的体细胞核移植和胚胎移植提供了可选的供体细胞。同时实验证明,在牛上,CRISPR/Cas9系统介导的基因打靶效率要明显高于ZFNs。