论文部分内容阅读
研究背景:肺癌是男性中致死率最高的恶性肿瘤,同时也是造成女性死亡率最高的第二大常见恶性肿瘤(仅次于乳腺癌)[1]。在我国,肺癌的发病率占全世界肺癌发病率的1/3左右,且有不断上升趋势[2]。肺癌的发病机理尚不清楚,缺乏有效的对因治疗方法,因此寻找灵敏度更高的分子标志物可为肺癌的早期诊断和治疗提供新的实验参考和理论基础。目的:本研究拟构建出由金纳米棒为核心的具有肿瘤靶向性、高载药能力及能产生良好光热效应(PTT)的纳米基因载体GNR@Si O2-SA-PEI-FA(FA-GNR),检测FA-GNR的细胞毒性、转染效率、光热效应等,明确mi R-101与RIPK1的关系及FA-GNR介导的PTT对坏死性凋亡(necroptosis)的影响,探讨mi R-101在FA-GNR介导的PTT下对坏死性凋亡的作用以及机制。方法:1.通过逐层合成法制备新型复合纳米材料FA-GNR,并采用紫外吸收光谱、Zeta电位测量仪、核磁共振氢谱、透射电子显微镜检测FA-GNR的各项表征。2.近红外激光发射仪和红外照相机检测FA-GNR的光热转化能力。3.琼脂糖凝胶电泳实验检测FA-GNR对mi RNA的装载能力。4.CCK-8法检测FA-GNR对A549细胞的细胞毒性和杀伤能力。5.荧光显微镜和流式细胞仪检测FA-GNR/Cy3-mi R-101对A549细胞的转染效率。6.小动物活体成像和冰冻切片检测FA-GNR的肿瘤靶向性。7.通过双荧光素酶、q-PCR、Western-blot检测明确RIPK1是mi R-101的靶基因之一。8.通过q-PCR及Western-blot检测FA-GNR转染mi R-101 mimics、mi R-101inhibitor至A549细胞,细胞内RIPK1表达水平的变化。9.在A549细胞中,通过CCK-8法、Transwell、划痕实验、克隆形成实验检测转染mi R-101 mimics、mi R-101 inhibitor对其增殖、侵袭、迁移、集落形成能力的影响。10.利用CRISPR/Cas9技术构建RIPK3-KO A549细胞,采用q-PCR、Western-blot及DNA测序检测目的基因敲除情况。采用CCK-8法检测PTT处理WT A549细胞和RIPK3-KO A549细胞后的细胞活力,q-PCR法检测mi R-101的表达情况。11.将FA-GNR/miR-101 mimics、FA-GNR/mi R-101 inhibitor分别转染至WT A549细胞和RIPK3-KO A549细胞,进行PTT处理;采用CCK-8法检测细胞活力,Western-blot检测各组细胞内RIPK1、RIP3、MLKL、p-MLKL的表达水平。结果:1.与GNR相比,FA-GNR的紫外吸收光谱发生了明显红移;Zeta电位有显著提高;核磁共振氢谱结果显示该纳米材料成功连上叶酸分子;TEM结果显示该纳米颗粒尺寸大小一致,硅层均匀包裹在GNR表面,具有较好的分散性。2.近红外激光发射仪和红外照相机检测结果显示FA-GNR有良好的光热转化能力,其与光照时间、材料浓度、光照强度有关。3.琼脂糖凝胶电泳结果显示FA-GNR与mi R-101的质量比到达6:1时,mi R-101可被FA-GNR完全负载。4.CCK-8结果显示,FA-GNR浓度高达105μg/m L时,细胞活力仍在90%左右,表明该材料的细胞毒性较低。5.FA-GNR具有优异的光热转化能力,其浓度为60μg/m L并进行PTT处理后,对癌细胞杀伤效率可达80%左右。6.荧光显微镜和流式细胞术结果显示FA-GNR对mi R-101的转染效率高,可达到95%以上。7.小动物活体成像和冰冻切片结果显示,Cy3-mi R-101经FA-GNR转染后在肿瘤组织中有明显蓄积的红色荧光,表明FA-GNR具有良好的肿瘤靶向性。8.双荧光素酶检测结果显示,RIPK1是mi R-101的靶基因;q-PCR、Western-blot结果显示,转染mi R-101 mimics至A549细胞可显著下调RIPK1的表达水平,转染mi R-101 inhibitor可上调细胞中RIPK1的表达水平。9.q-PCR、Western-blot结果显示,采用FA-GNR将mi R-101转染至A549细胞中,mi R-101 mimics组的RIPK1表达较低,mi R-101 inhibitor组中的RIPK1表达较高。10.mi R-101 mimics可抑制A549细胞的增殖、侵袭、迁移及集落形成能力,而mi R-101 inhibitor可增强A549细胞的增殖、侵袭、迁移及集落形成能力。11.q-PCR、Western-blot及DNA测序成功筛选出RIPK3-KO A549细胞株。CCK-8检测结果显示,RIPK3-KO A549细胞在PTT处理后的细胞死亡率更低;q-PCR结果显示,进行PTT处理后WT A549细胞内mi R-101的表达水平显著降低。12.当A549细胞中的RIPK3被敲除后,由PTT(由FA-GNR介导)联合mi R-101 inhibitor诱导的坏死性凋亡途径被抑制。结论:1.FA-GNR的生物相容性和光热效应优异,毒性极低且易于清除,具有极好的载药能力和转染能力,可在体内将负载的药物高效率靶向递送至肿瘤部位。2.mi R-101 mimics可显著下调A549细胞中RIPK1的表达水平,mi R-101inhibitor可上调细胞中RIPK1的表达水平。mi R-101 mimics可抑制A549细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力,而mi R-101 inhibitor可增强A549细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力。3.FA-GNR介导的PTT效应可使A549细胞中的mi R-101表达水平降低,并启动坏死性凋亡程序。4.mi R-101 inhibitor在FA-GNR介导的PTT下显著增强了A549细胞的坏死性凋亡。