论文部分内容阅读
目的：
鸦胆子油(Brucea javanica oil，BJO)，是以鸦胆子(Brucea javanica (L.)Merr)的干燥成熟果实为原料，经石油醚提取所得的脂肪油。本品为黄色的澄清液体，气特异，味苦。临床上鸦胆子油多作为治疗肿瘤的联合放、化疗药物。以鸦胆子油为原料，精制大豆磷脂为乳化剂制成的鸦胆子油乳(Bruceajavanicaoil emulsion，BJOE)口服制剂和静脉制剂是其主要临床应用剂型。
研究人员从鸦胆子中分离得到多种天然产物，除大量脂肪油之外，还分离得到的苦木内酯成分，这类成分具有很强的抗肿瘤和抗肠炎活性，同时也是鸦胆子的特征性成分。其中，鸦胆子苦醇(Brusatol)，是鸦胆子苦木内酯类中含量最多的成分，被认为是鸦胆子主要药效成分之一。
目前，鸦胆子油及鸦胆子油乳制剂均以油酸为质量标准进行质量控制。尚无鸦胆子油中苦木内酯的检测研究及相关报道。前期研究发现鸦胆子油和苦木内酯均具有抗腹水瘤和抗溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis ，UC)的作用，但是鸦胆子油中是否含有苦木内酯，及鸦胆子油药效是否和苦木内酯密切相关尚不明确。本研究目的是探讨鸦胆子油中苦木内酯对治疗腹水瘤及溃疡性结肠炎的影响。采用乙醇富集的方法，精制富含苦木内酯鸦胆子油，以小鼠腹水瘤模型评价其药效；同时，以DSS诱导小鼠UC模型，评价富含苦木内酯鸦胆子油对UC的影响，并初步探讨其抗UC作用机制。方法：
1.鸦胆子油中苦木内酯HPLC检测方法的建立
供试品溶液的制备：取鸦胆子油1g，加入10mL甲醇超声萃取5min后，离心分取上层萃取液。重复上述操作两次。合并萃取液去除甲醇，加入1mL甲醇溶解备用。取用水-甲醇活化后的C18固相萃取柱，将上述甲醇溶液以1mL/min的速率上样，2mL甲醇洗脱。收集洗脱液去除甲醇，加入甲醇定容至1mL，作为供试品溶液。
高效液相色谱法(HPLC)检测条件(以鸦胆子苦醇为检测指标)：Prontosil120-3-C18-ace-EPS色谱柱(2.0mm×100mm，5μm)，流动相：水(A)和甲醇(B)，(0-2 min，5-7% B；2-5 min，7-30% B；5-15 min，30-45% B；15-25 min, 45-60% B)，流速0.5mL/min，柱温30℃，进样量：10μL，检测波长254nm。
HPLC方法学考察：对以上HPLC检测条件进行方法学考察，内容包括：标准曲线绘制、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等。
2.鸦胆子油中苦木内酯的富集
取鸦胆子油(BJO)200g，加入95%乙醇1000mL，超声提取1h，静置1h，分取上层液。重复3次。合并上层提取液，80℃进行减压浓缩至无醇味，经HPLC检测富含鸦胆子苦醇，标记为富含苦木内酯鸦胆子油(BE-BJO)；收集下层液，80℃减压浓缩至无醇味，经HPLC检测不含鸦胆子苦醇，标记为不含苦木内酯鸦胆子油(BF-BJO)。并将上述BJO、BE-BJO和BF-BJO分别制备油乳制剂得BJOE、BE-BJOE和BF-BJOE。
3.苦木内酯对鸦胆子油抗腹水瘤的影响
以雄性KM小鼠为实验动物，腹腔注射H22肝癌细胞(1×106cells/只)建立小鼠腹水瘤模型。除阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CTX，30 mg/kg)外，其余各组分别灌胃给予小鼠乳剂：鸦胆子油组(BJO，2000mg/kg)，富含苦木内酯鸦胆子油组(BE-BJO，610mg/kg)以及不含苦木内酯鸦胆子油组(BF-BJO，2000mg/kg)，每日一次，连续7天。每天观察小鼠生活状态，统计小鼠生存时间，进行生存周期分析。在生存周期分析的基础上，复制H22腹水瘤小鼠模型，每天记录小鼠体重和腹围大小。第8天处死小鼠，计算每组小鼠免疫器官指数，测定小鼠腹水体积，腹水细胞活力及细胞凋亡情况。检测腹水细胞p53、Bax、Bcl-2、Bad、CytochromeC、Caspase-9(cleaved)、Caspase-3(cleaved)、PARP-1、PARP-1(cleaved)蛋白以及miRNA-29bmRNA的表达情况。
4.苦木内酯对鸦胆子油抗溃疡性结肠炎的影响
以雄性Balb/C小鼠为实验鼠，除正常组外，其它小鼠自由饮用3%DSS水溶液(临用时以蒸馏水新配)，连续7天，诱导小鼠溃疡性结肠炎。模型建立同时，各组小鼠每天分别灌胃给予相应治疗药物：鸦胆子油组(BJO，2000mg/kg)，富含苦木内酯鸦胆子油高、中、低剂量组(BE-BJO，610mg/kg、305mg/kg、152.5mg/kg)，不含苦木内酯鸦胆子油组(BF-BJO，2000mg/kg)，美沙拉嗪组(5-ASA，200mg/kg)。其中正常组和模型组每日分别灌胃给予等量的蒸馏水和大豆卵磷脂乳液。每日一次，连续7天。每天记录小鼠体重。第8天处死小鼠，计算小鼠疾病活动指数，观察结肠损伤情况(结肠长度变化，结肠组织病理学变化)，Elisa法检测结肠组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达水平；Q-PCR检测结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2的mRNA含量表达情况；Westernblot检测结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2、E-cadherin、MLC、p-MLC、ROCK-1、GTPRhoA、TotalRhoA、p65和p-p65蛋白表达情况。
结果：
1.鸦胆子油中苦木内酯HPLC检测方法的建立
采用Prontosil120-3-C18-ace-EPS(2.0mm×100mm，5μm)为色谱柱；以水(A)和甲醇(B)流动相，0.5mL/min梯度洗脱(0-2min，5-7%B；2-5min，7-30%B；5-15min，30-45%B；15-25min，45-60%B)；柱温30℃；检测波长为254nm条件下，在鸦胆子油中可以检测出苦木内酯成分鸦胆子苦醇。鸦胆子苦醇特征峰在鸦胆子油色谱中可达到良好分离效果。其检出限为0.8μg/mL，在2.5-80μg/mL范围内，线性关系良好；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；平均加样回收率在98%-102%之间，RSD均小于2%。
2.鸦胆子油中苦木内酯的富集
HPLC测定鸦胆子苦醇含量，BJO含4.09μg/g，BE-BJO含13.08μg/g，BF-BJO中未检出鸦胆子苦醇。分别制备油乳制剂，其相应的鸦胆子苦醇含量分别为0.818μg/mL，0.798μg/mL和0μg/mL。
3.苦木内酯对鸦胆子油抗腹水瘤的影响
小鼠腹水瘤模型实验结果显示，BJO和BE-BJO均能显著延长腹水瘤小鼠的生存时间，而BF-BJO对腹水瘤小鼠生存时间无明显延长作用。除此之外，BJO和BE-BJO能够不同程度的抑制小鼠体重和腹围的增加，降低腹水体积和腹水细胞活力，提高细胞凋亡率，上调miRNA-29b，调节p53介导的凋亡通路相关蛋白的表达，并且无免疫器官毒性。
4.苦木内酯对鸦胆子油抗溃疡性结肠炎的影响
小鼠UC模型实验结果显示，，BJO和BE-BJO均能缓解小鼠体重减轻状况，恢复结肠长度，降低小鼠DAI评分，而BF-BJO不具有上述作用。除此之外，BJO和BE-BJO能够不同程度地降低结肠组织病理学评分，降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达水平，调节紧密连接(ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2)mRNA和蛋白的表达以及RhoA/ROCK通路其它相关蛋白的表达。
结论：
1.鸦胆子油中含有苦木内酯成分鸦胆子苦醇。
2.苦木内酯是鸦胆子油通过p53介导的凋亡途径，达到抗腹水瘤作用的主要有效成分，而油脂成分不是。
3.苦木内酯是鸦胆子油通过调节RhoA/ROCK通路相关蛋白，达到抗溃疡性结肠炎作用的主要有效成分，而油脂成分不是。
鸦胆子油(Brucea javanica oil，BJO)，是以鸦胆子(Brucea javanica (L.)Merr)的干燥成熟果实为原料，经石油醚提取所得的脂肪油。本品为黄色的澄清液体，气特异，味苦。临床上鸦胆子油多作为治疗肿瘤的联合放、化疗药物。以鸦胆子油为原料，精制大豆磷脂为乳化剂制成的鸦胆子油乳(Bruceajavanicaoil emulsion，BJOE)口服制剂和静脉制剂是其主要临床应用剂型。
研究人员从鸦胆子中分离得到多种天然产物，除大量脂肪油之外，还分离得到的苦木内酯成分，这类成分具有很强的抗肿瘤和抗肠炎活性，同时也是鸦胆子的特征性成分。其中，鸦胆子苦醇(Brusatol)，是鸦胆子苦木内酯类中含量最多的成分，被认为是鸦胆子主要药效成分之一。
目前，鸦胆子油及鸦胆子油乳制剂均以油酸为质量标准进行质量控制。尚无鸦胆子油中苦木内酯的检测研究及相关报道。前期研究发现鸦胆子油和苦木内酯均具有抗腹水瘤和抗溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis ，UC)的作用，但是鸦胆子油中是否含有苦木内酯，及鸦胆子油药效是否和苦木内酯密切相关尚不明确。本研究目的是探讨鸦胆子油中苦木内酯对治疗腹水瘤及溃疡性结肠炎的影响。采用乙醇富集的方法，精制富含苦木内酯鸦胆子油，以小鼠腹水瘤模型评价其药效；同时，以DSS诱导小鼠UC模型，评价富含苦木内酯鸦胆子油对UC的影响，并初步探讨其抗UC作用机制。方法：
1.鸦胆子油中苦木内酯HPLC检测方法的建立
供试品溶液的制备：取鸦胆子油1g，加入10mL甲醇超声萃取5min后，离心分取上层萃取液。重复上述操作两次。合并萃取液去除甲醇，加入1mL甲醇溶解备用。取用水-甲醇活化后的C18固相萃取柱，将上述甲醇溶液以1mL/min的速率上样，2mL甲醇洗脱。收集洗脱液去除甲醇，加入甲醇定容至1mL，作为供试品溶液。
高效液相色谱法(HPLC)检测条件(以鸦胆子苦醇为检测指标)：Prontosil120-3-C18-ace-EPS色谱柱(2.0mm×100mm，5μm)，流动相：水(A)和甲醇(B)，(0-2 min，5-7% B；2-5 min，7-30% B；5-15 min，30-45% B；15-25 min, 45-60% B)，流速0.5mL/min，柱温30℃，进样量：10μL，检测波长254nm。
HPLC方法学考察：对以上HPLC检测条件进行方法学考察，内容包括：标准曲线绘制、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等。
2.鸦胆子油中苦木内酯的富集
取鸦胆子油(BJO)200g，加入95%乙醇1000mL，超声提取1h，静置1h，分取上层液。重复3次。合并上层提取液，80℃进行减压浓缩至无醇味，经HPLC检测富含鸦胆子苦醇，标记为富含苦木内酯鸦胆子油(BE-BJO)；收集下层液，80℃减压浓缩至无醇味，经HPLC检测不含鸦胆子苦醇，标记为不含苦木内酯鸦胆子油(BF-BJO)。并将上述BJO、BE-BJO和BF-BJO分别制备油乳制剂得BJOE、BE-BJOE和BF-BJOE。
3.苦木内酯对鸦胆子油抗腹水瘤的影响
以雄性KM小鼠为实验动物，腹腔注射H22肝癌细胞(1×106cells/只)建立小鼠腹水瘤模型。除阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CTX，30 mg/kg)外，其余各组分别灌胃给予小鼠乳剂：鸦胆子油组(BJO，2000mg/kg)，富含苦木内酯鸦胆子油组(BE-BJO，610mg/kg)以及不含苦木内酯鸦胆子油组(BF-BJO，2000mg/kg)，每日一次，连续7天。每天观察小鼠生活状态，统计小鼠生存时间，进行生存周期分析。在生存周期分析的基础上，复制H22腹水瘤小鼠模型，每天记录小鼠体重和腹围大小。第8天处死小鼠，计算每组小鼠免疫器官指数，测定小鼠腹水体积，腹水细胞活力及细胞凋亡情况。检测腹水细胞p53、Bax、Bcl-2、Bad、CytochromeC、Caspase-9(cleaved)、Caspase-3(cleaved)、PARP-1、PARP-1(cleaved)蛋白以及miRNA-29bmRNA的表达情况。
4.苦木内酯对鸦胆子油抗溃疡性结肠炎的影响
以雄性Balb/C小鼠为实验鼠，除正常组外，其它小鼠自由饮用3%DSS水溶液(临用时以蒸馏水新配)，连续7天，诱导小鼠溃疡性结肠炎。模型建立同时，各组小鼠每天分别灌胃给予相应治疗药物：鸦胆子油组(BJO，2000mg/kg)，富含苦木内酯鸦胆子油高、中、低剂量组(BE-BJO，610mg/kg、305mg/kg、152.5mg/kg)，不含苦木内酯鸦胆子油组(BF-BJO，2000mg/kg)，美沙拉嗪组(5-ASA，200mg/kg)。其中正常组和模型组每日分别灌胃给予等量的蒸馏水和大豆卵磷脂乳液。每日一次，连续7天。每天记录小鼠体重。第8天处死小鼠，计算小鼠疾病活动指数，观察结肠损伤情况(结肠长度变化，结肠组织病理学变化)，Elisa法检测结肠组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达水平；Q-PCR检测结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2的mRNA含量表达情况；Westernblot检测结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2、E-cadherin、MLC、p-MLC、ROCK-1、GTPRhoA、TotalRhoA、p65和p-p65蛋白表达情况。
结果：
1.鸦胆子油中苦木内酯HPLC检测方法的建立
采用Prontosil120-3-C18-ace-EPS(2.0mm×100mm，5μm)为色谱柱；以水(A)和甲醇(B)流动相，0.5mL/min梯度洗脱(0-2min，5-7%B；2-5min，7-30%B；5-15min，30-45%B；15-25min，45-60%B)；柱温30℃；检测波长为254nm条件下，在鸦胆子油中可以检测出苦木内酯成分鸦胆子苦醇。鸦胆子苦醇特征峰在鸦胆子油色谱中可达到良好分离效果。其检出限为0.8μg/mL，在2.5-80μg/mL范围内，线性关系良好；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；平均加样回收率在98%-102%之间，RSD均小于2%。
2.鸦胆子油中苦木内酯的富集
HPLC测定鸦胆子苦醇含量，BJO含4.09μg/g，BE-BJO含13.08μg/g，BF-BJO中未检出鸦胆子苦醇。分别制备油乳制剂，其相应的鸦胆子苦醇含量分别为0.818μg/mL，0.798μg/mL和0μg/mL。
3.苦木内酯对鸦胆子油抗腹水瘤的影响
小鼠腹水瘤模型实验结果显示，BJO和BE-BJO均能显著延长腹水瘤小鼠的生存时间，而BF-BJO对腹水瘤小鼠生存时间无明显延长作用。除此之外，BJO和BE-BJO能够不同程度的抑制小鼠体重和腹围的增加，降低腹水体积和腹水细胞活力，提高细胞凋亡率，上调miRNA-29b，调节p53介导的凋亡通路相关蛋白的表达，并且无免疫器官毒性。
4.苦木内酯对鸦胆子油抗溃疡性结肠炎的影响
小鼠UC模型实验结果显示，，BJO和BE-BJO均能缓解小鼠体重减轻状况，恢复结肠长度，降低小鼠DAI评分，而BF-BJO不具有上述作用。除此之外，BJO和BE-BJO能够不同程度地降低结肠组织病理学评分，降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达水平，调节紧密连接(ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2)mRNA和蛋白的表达以及RhoA/ROCK通路其它相关蛋白的表达。
结论：
1.鸦胆子油中含有苦木内酯成分鸦胆子苦醇。
2.苦木内酯是鸦胆子油通过p53介导的凋亡途径，达到抗腹水瘤作用的主要有效成分，而油脂成分不是。
3.苦木内酯是鸦胆子油通过调节RhoA/ROCK通路相关蛋白，达到抗溃疡性结肠炎作用的主要有效成分，而油脂成分不是。