在医学上,癌症又被称之为恶性肿瘤。在各种致癌因素的作用下,局部组织细胞的基因失去了对其生长的正常调控,因此其细胞可以异常增生与分化,进而形成了肿瘤。肿瘤的发生是一个长期多阶段、多基因改变与积累的过程,具有基因控制和多因素调节的复杂性。在中国,癌症的发生率和死亡率持续增高。自2010年以来,癌症成为了导致死亡的主要原因,也成为我国的主要公共卫生问题。2017年,美国有1688780的癌症新增病例和600920的癌症死亡病例,癌症成为其第二大死亡因素。目前治疗恶性肿瘤的传统方法有三种:手术、放射、化学药物治疗。化疗的地位及其重要,不可替代。其中手术与放射疗法属于局部治疗,而化学药物治疗属于全身治疗,随着血液循环化学药物可以遍布全身绝大部分组织与器官,在杀死肿瘤细胞的同时会对正常的组织细胞造成伤害,导致化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞选择性差、毒副作用大的缺点。因此,研发高效且低毒的抗肿瘤药物一直是人们不懈努力的奋斗目标。目前,癌症化疗中最常用的抗癌药物为铂类抗癌药物。自从20世纪60年代美国密执安州立大学的Rosenberg教授发现顺铂有抗癌活性,开辟了金属铂络合物抗癌作用研究的新领域以来,已有4个铂类抗癌药物被获准进入市场。这四个已上市的铂络合物大致经历了三代:第一代铂类抗癌药—顺铂、第二代铂类抗癌药—卡铂、第三代铂类抗癌药—奥沙利铂、奈达铂。但是在化疗过程中,肿瘤细胞对化疗药物可以产生多耐药性,这就导致有些肿瘤在经历了最初有效的化学疗法后,仍然会复发。虽然合理的联合化疗可以最大限度的发挥细胞毒作用,但是都可能会因为多药耐药的出现而失败。多药耐药是指在肿瘤细胞接触一种抗肿瘤药物以后,可以产生对多种有不同结构并且作用机制也各异的其他的抗肿瘤药物的耐药性。目前,肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最为重要的细胞防御机制就是多药耐药。多药耐药涉及临床中常用的多种抗肿瘤药物,成为了肿瘤成功化疗最为严重的障碍之一。比如,白血病、乳腺癌、肝癌、食道癌、结肠癌等均面临着严重的多药耐药问题。因此,开发一类新型的抗癌药物成为解决多药耐药这一难题的关键。通过查阅大量文献,从肿瘤细胞被杀死的机制出发,我们将研究点放在了多环芳烃上。多环芳烃通常被归类于具有慢性毒性的化学物质。作为π电子密集的多环芳烃衍生物可与DNA大分子产生相互作用,导致DNA损伤,例如形成DNA加合物、诱导DNA链断裂等。DNA链断裂是一种重要类型的DNA损伤,当癌细胞的DNA链中的碱基对由于π电子密集的多环芳烃化合物的插入作用而断裂或者形成解链时,癌细胞便由于无法继续复制DNA而产生凋亡。例如,多环芳烃蒽的衍生物作为抗肿瘤候选药物有许多研究和报道。同样,多环芳烃芘的衍生物作为有效的抗肿瘤化合物也有大量的文献报道。其中,阿霉素是一种从蒽类多环芳烃出发而成功开发的临床抗肿瘤药物,其适应症包括肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多种血癌。但临床研究发现阿霉素作为抗肿瘤药物在应用过程中存在较严重的心脏毒性,可引起迟发性严重心力衰竭。因此发现和开发新型的多环芳烃化合物,尤其是蒽类以外的多环芳烃抗肿瘤药物具有重要的意义。1996年,Barth与Lawton第一次合成了一种新型多环芳烃—碗烯。随后通过Siegel等人的不断努力,碗烯可以被公斤级的生产。过去的几十年里,科学家被碗烯的独特功能与性质深深吸引。碗烯(corannulene,Cor)是一种将五个苯环并入一个五元环结构的多环芳香碳氢化合物。碗烯具有三维拓扑的曲面结构,这种结构恰好是富勒烯的最小结构单元。碗烯的电子分布特殊并拥有较大的偶极,这些特点赋予了其独特的性能,比如拥有很强的接收电子的能力。碗烯的性质独特,已被广泛应用在了超分子化学、液晶、旋光活性、碳纳米管的合成研究、自由基和锂离子电池等领域。但是碗烯的水溶性很低,这一性质导致其在生物领域的应用受到了很大的限制。为了使碗烯能在生物领域发挥作用,使其具有很好的抗肿瘤活性,克服它的极低水溶性这一缺点成为了至关重要的一点。通过调研大量文献得知,三氮唑环有很多的优点,比如具有很高的稳定性及选择性,合成反应过程中副反应很少等等。无论是在碱性或酸性水解的条件下,还是氧化或还原的条件下三氮唑环的稳定性都很高。此外,这一杂环是氨基化合物的生物电子等排,能够和生物分子靶标通过氢键相结合。这一极具吸引力的生色团在很多药物里具有很好的活性,比如抗菌、抗真菌、抗过敏、抗艾滋病、抗结核、抗肿瘤、抗病毒、抗疟疾和抗惊厥药等等。此外,三氮唑环还可以与DNA发生相互作用并作为DNA靶向药物的一个重要部分。基于以上研究,本课题从碗烯的分子结构出发,设计并合成了三种碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物,希望糖分子的引入能够解决碗烯的水溶性难题,使其能够顺利进入细胞,降低对正常组织的伤害,选择性杀伤肿瘤细胞。同时,设计了三种苝-1,2,3-三唑糖偶联物作为对照。但是通过实验发现,同样的条件下,苝-1,2,3-三唑糖偶联物的水溶性远远低于碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物的水溶性。我们通过核磁共振氢谱、碳谱、质谱和红外等方法证明了所有不同糖通过点击化学方法与碗烯以及苝形成的偶联物的成功合成。为了评价新合成的碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物对人类肿瘤细胞的细胞毒性,我们选用了人体的HepG2肿瘤细胞对这些化合物进行了体外MTT毒性评价。测试表明所合成的三种碗烯化合物具有很好的杀死肿瘤细胞的能力,其中药效最好的为碗烯-1,2,3-三唑半乳糖偶联物。如前文所述,作为π电子密集的多环芳烃衍生物可与DNA大分子产生相互作用,导致DNA损伤,从而使癌细胞由于无法继续复制DNA而产生凋亡。由于DNA的二级结构中存在大沟和小沟,二者构成了小分子化合物与DNA之间相互作用的位点。小分子化合物与DNA之间的相互作用方式包括四种类型:长距组装、共价结合、非共价结合和剪切作用。经研究表明,小分子化合物与DNA之间的相互作用的主要方式为非共价结合。非共价结合方式主要包括三种:静电作用、沟槽作用、嵌插作用。而嵌插作用又分为经典嵌插作用和非经典嵌插(部分插入)作用两种。其中静电作用有较差的选择性以及对DNA结构较弱的影响性。大多数的小分子化合物可以在DNA的小沟区特异性地与其发生相互作用,并且这些典型的小分子化合物的结构中都含有芳香环。嵌插作用的主要作用力包括三种:芳香环离域π体系和碱基之间的π-π堆积相互作用力;疏水相互作用力;偶极-偶极相互作用力。影响非共价结合的主要因素有DNA同小分子化合物的配比、反应介质的pH值以及离子强度等等。DNA同小分子化合物的作用方式可能会随着反应条件的变化而变化,所以非共价结合也被称之为可逆结合。小分子化合物同DNA之间的相互作用机理的研究方法主要包括光谱法、电化学法以及黏度法。其中,由于光谱法具有很多的优点,比如操作简便、高效、经济等。由于这些优点,光谱法成为了研究小分子化合物同DNA之间相互作用的最常用并且有效的方法。光谱法通常包括紫外-可见吸收光谱法、圆二色光谱(CD)法、拉曼光谱法、线二色谱法、傅立叶变换红外光谱法、共振光散射光谱法及荧光光谱法等。因此为了探究碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物杀死癌细胞的作用机制是否是通过与癌细胞的DNA发生作用,我们采用上述研究手段做了一系列的相关实验。本论文主要包括以下三种测试方法:(1)在pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系,温度为25 ~oC条件下应用紫外-可见光谱法对化合物与HsDNA的相互作用进行研究。由于DNA的双螺旋链中的碱基都有共轭双键,DNA在波长为260 nm左右处会有较强的紫外吸收峰,具有一定的光化学活性。当小分子化合物与DNA发生相互作用后,DNA的紫外吸收光谱可能会有吸收谱带变宽、减色或增色效应以及红移或者蓝移的现象。如果小分子与DNA发生的相互作用方式为经典插入,则DNA的最大吸收峰的吸光度会发生减色红移。如果小分子与DNA发生的相互作用方式是静电或者沟槽,则DNA的最大吸收峰会出现减色效应不明显以及红移的现象。本论文中的紫外-可见光谱法测定。实验的研究结果表明,所合成的碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物使HsDNA的最大吸收峰增色并且位移没有发生改变,初步排除碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物与Hs-DNA之间存在经典嵌插作用的可能性。(2)在pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系,温度为25 ~oC条件下应用圆二色光谱法对化合物与HsDNA的相互作用进行研究。HsDNA的圆二色光谱有两个特征峰,即在波长为249 nm处,由于B螺旋构像导致的负向吸收峰,以及在波长为275 nm处,由于碱基堆积导致的正向吸收峰。本论文中圆二色光谱(CD)法测定实验的研究结果表明,碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物使HsDNA的正向峰的最大吸收强度减小,这就意味着碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物有可能部分插入到了HsDNA的碱基对中导致其碱基堆积的减弱。另外,碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物使HsDNA的正向峰的最大吸收强度增强(向0水平线移动),并且波长位置并没有发生大的改变,表明HsDNA构像的变化很小。HsDNA的正向峰与负向峰的改变表明碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物与HsDNA之间可能存在非经典嵌插(部分插入)的作用。(3)在pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系,温度为25℃条件下应用黏度法对化合物与HsDNA的相互作用进行研究。黏度法是一种研究小分子化合物同DNA间相互作用及作用机理的又一种常用的技术手段。如果小分子与DNA发生的作用为嵌插,则DNA双螺旋链中相邻碱基对的距离需要足够大,这样才能够容纳该小分子,进而直接导致的结果是DNA双螺旋链膨胀伸长,使相应的黏度增大。如果小分子与DNA发生静电或沟槽作用,DNA的双螺旋链就不会膨胀伸长,因此黏度也就不会有太大的变化。如果小分子与DNA发生作用的方式为非经典插入,DNA双螺旋链将会扭曲变形,进而DNA双螺旋链间接触面降低,故而黏度降低。本论文的粘度测定实验所得的研究结果表明,随着碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物的浓度的增强,粘度值急剧降低。这就表明碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物与HsDNA之间可能存在非经典嵌插的作用。通过对以上实验结果所得谱图的数据的综合分析,可以得出以下结论:其作用机理为碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物与HsDNA分子之间相互作用的方式可能为部分插入作用,从而影响了肿瘤细胞DNA的复制、转录等生物学功能,进而有良好的抗肿瘤活性。本课题中碗烯-1,2,3-三唑糖偶联物克服了碗烯的水难溶性的问题,并且具有很好的抗肿瘤活性作用。