象山港海区是中国重要渔业资源区以及海水养殖区，岛屿众多，环境异质性高，陆源径流丰富，浮游动植物生物多样性高。同时，浙江及东南沿海其他海域又是中国的主要赤潮发生地，赤潮灾害问题非常严重，不仅发生频率和范围呈现上升的趋势，新的有害赤潮种类爆发的赤潮问题也尤为突出。本文针对海水养殖区常发的四种典型赤潮藻种类（剧毒卡罗藻，东海原甲藻，中肋骨条藻和小普林藻），建立了环介导等温扩增技术（LAMP-LFD）快速检测方法，形成了养殖区典型有毒有害赤潮藻的快速检测方法和产品；应用该快速检测方法，并结合荧光定量PCR方法和高通量测序技术，对象山港养殖海域代表性站位的真核藻类群落结构及动态变化进行了研究，分析了赤潮藻种类与关键环境因子的相关性分析。实现了养殖区典型有毒有害藻种的低生物量时的灵敏检出，对赤潮发生预警和预报具有重要的作用。主要研究结果如下：
　　（一）通过以剧毒卡罗藻，东海原甲藻，中肋骨条藻和小普林藻为研究对象，利用在线生物信息学分析软件以四种常见有害藻的特异性基因序列为靶标序列设计适于LAMP扩增的特异性引物和探针，并结合成熟的LFD试纸条技术，构建安全、快速、便捷的LAMP-LFD检测方法。针对剧毒卡罗藻特异性的ITS基因设计了四组LAMP的引物。结果表明，LAMP-LFD对剧毒卡罗藻基因组DNA的检测线是7.4pg/μL比常规普通PCR灵敏10倍。该方法检测剧毒卡罗藻的分离株具有高特异性和准确性，而对其他藻的分离株检测呈阴性结果。以东海原甲藻的ITS基因序列为检测靶标，设计3对特异性引物。经优化后的LAMP最适条件为63℃反应30min，较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明，LAMP-LFD可特异性检出东海原甲藻，对常见赤潮藻检测结果均为阴性；其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL，是常规PCR技术（以F3和B3为引物）的10倍。基于中肋骨条藻特有的保守DNA序列，我们所设计了四组LAMP引物。LAMP-LFD检测最低限为0.94pg/μL，比常规PCR灵敏度高100倍。以小普林藻ITS为靶序列，设计了三对特异性引物。LAMP的最佳反应条件为65℃扩增45h。只需要约50min即可用LFD可视化结果，这比常规PCR短约2.5h。此外，LAMP-LFD方法具有优异的特异性，对其他常见有害藻类检测均显示阴性结果。它可以检测到最低浓度为3×10-2ng/μL的基因组DNA。
　　（二）根据剧毒卡罗藻，东海原甲藻，中肋骨条藻和小普林藻的特异性靶基因序列设计和合成相应的特异性荧光定量PCR引物，通过分子克隆分别制备了四种藻的靶基因序列片段重组质粒。通过特异性引物和所制备的重组质粒建立了四种藻含有SYBR Green1染料的荧光定量PCR检测方法。以上方法均通过纯种藻和混合藻样品检测，结果表明该方法特异性高，不受所加对应藻的干扰，满足四种藻的特异性定量检测。运用以上所建立的定量方法，对在2018年2月，3月，4月和5月采集自东海象山港的现场样品进行了分析，并将阳性结果与单克隆测序结果进行比较。结果表明，该方法与阳性样品测序结果一致，并可以准确、快速的检测目标藻的存在与数量多少。通过本文所建立的四种藻的荧光定量PCR检测方法，分析和探讨了象山港6个站点连续4个月的所有样本中剧毒卡罗藻，东海原甲藻，中肋骨条藻和小普林藻的藻细胞数量关系。
　　（三）根据真核生物18S rDNA基因运用V4高变区通用引物对象山港海区水样进行扩增测序和分析。Miseq高通量测序总共获得3223945条高质量18S rRNA基因序列，以97%的相似水平下的OTU进行生物信息学统计分析，共获得9186个OTUs。其中unclassified类在门水平占据比例高达70.67%，节肢动物门(Arthropoda)占18.44%，绿藻门(Chlorophyta)占2.50%，硅藻门(Bacillariophyta)占2.08%，甲藻门(Dinoflagellata)占0.30%。2月份，3月份，4月份和5月份象山港海域真核生物群落的多样性分析结果表明，ACE、Chao1、Shannon和Simpson均有显著性差异(P＜0.001)。环境因子与真核生物群落的关系由RDA分析结果可知，环境因子中温度对所有样品的影响最大，其次是悬浮颗粒，透明度和盐度。采用BioEnv筛选出了对藻类群落变异最相关(r=0.55)的环境因子组合为盐度，溶解氧，叶绿素a，硝酸盐和磷酸盐。而3月份藻类群落受硝酸盐影响最大，硝酸盐与藻类生长有很密切的关系。