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大白菜是我国重要的蔬菜作物之一,其食用器官主要是由叶片弯曲抱合形成的叶球。在大白菜生长过程中,苗期和莲座期叶片平展生长,结球期叶片则趋于直立生长,并逐渐向内弯曲抱合,形成叶球。近年来,随着分子生物学技术的发展,对大白菜叶片生长发育的机制有所研究,但其叶片弯曲等生长发育相关基因有待于进一步挖掘,其调控机制依然有待于深入探讨。本研究的试验材料为EMS诱变获得的大白菜叶片卷曲突变体dcl1(downward-curling leaf1)和其野生型WT,dcl1突变体苗期叶片向外卷曲生长,整个生育期叶片生长缓慢。通过表型鉴定及生理指标测定,揭示大白菜叶片卷曲和矮小性状与光合速率及激素含量的相关性;利用F2分离群体对卷叶和矮化性状进行遗传分析,利用MutMap和KASP基因分型技术定位候选基因,并通过转录组测序技术分析不同发育阶段的差异基因在转录水平的表达差异。主要试验结果如下:
1.突变体dcl1苗期叶片发生向外向下卷曲,越早发育的叶片,卷曲指数越大;dcl1叶片的叶长和叶宽生长速率显著低于野生型WT,株高、株展、球高、球重也显著小于野生型;生理特征方面,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量与野生型元显著差异;净光合速率、蒸腾速率、蒸腾量、气孔导度均低于野生型,而胞间CO2浓度无差异。苗期卷曲叶片的脱落酸、生长素、水杨酸的含量明显低于野生型。
2.通过F1性状可知,突变体的卷叶和矮化均为半显性遗传,对突变体的卷叶性状的F2分离群体进行调查,符合3∶1的分离比例,BC1符合1∶1分离比。通过MutMap技术对F2分离群体中极端性状的单株混池测序,明确候选基因区间为A06上292291-391666碱基之间,利用KASP分型确定候选基因为BraA06g003880.3C。
3.利用育种中常用的自交系亲本85-1与dcl1创建F2分离群体,与之前构建的dcl1与野生型的F2群体共同进行矮化性状的基因定位,获得与卷叶相同的候选基因区间,通过KASP技术检测,BraA06g003880.3C在矮化F2群体中的性状与基因型相符。推测认为dcl1中植株矮小和卷叶的基因为同一个基因。
4.BraA06g003880.3C基因DNA全长1226bp,CDS序列全长914bp,包含一个典型的MYB结构域。在dcl1中第442位碱基由A变为G。这一突变发生在基因的选择性剪切位点,导致基因剪切发生错误,保留的内含子中含有终止子,基因的翻译存MYB结构域前终止。
5.根据叶片生长的不同时期进行转录组取样,叶片发育初期,GO富集得到类囊体膜、类囊体等光合作用相关的分类差异显著,KEGG富集结果显示,dcl1的光合途径中,PsbQ等基因下调表达。光合固碳途径涉及的酶类的编码基因转录水平下调。这可能导致叶片积累干物质的最减少。叶片生长后期,物质转运相关基因的转录水平发生明显变化。光合性能的损伤可能是dcl1植株显著变小的关键。
6.转录组取材的第二个时期在卷叶发生时期,这一时期生长素和脱落酸的合成和响应活跃,尤其是生长素合成YUCCA的上调,可导致生长素的累积。在生长素响应途径中富集到21个基因,有20个转录水平显著上调。喷施外源生长素之后大白菜叶片向下卷曲,对叶片喷施生长素转运抑制剂之后,叶片由直立变为平塌。因此,生长素的积累和转运可能是导致叶片卷曲的关键。
该研究为挖掘大白菜叶片卷曲和矮小的新型基因资源提供了良好的试验材料,也为进一步揭示大白菜叶片卷曲及矮小性状的分子调控机制奠定了基础。
1.突变体dcl1苗期叶片发生向外向下卷曲,越早发育的叶片,卷曲指数越大;dcl1叶片的叶长和叶宽生长速率显著低于野生型WT,株高、株展、球高、球重也显著小于野生型;生理特征方面,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量与野生型元显著差异;净光合速率、蒸腾速率、蒸腾量、气孔导度均低于野生型,而胞间CO2浓度无差异。苗期卷曲叶片的脱落酸、生长素、水杨酸的含量明显低于野生型。
2.通过F1性状可知,突变体的卷叶和矮化均为半显性遗传,对突变体的卷叶性状的F2分离群体进行调查,符合3∶1的分离比例,BC1符合1∶1分离比。通过MutMap技术对F2分离群体中极端性状的单株混池测序,明确候选基因区间为A06上292291-391666碱基之间,利用KASP分型确定候选基因为BraA06g003880.3C。
3.利用育种中常用的自交系亲本85-1与dcl1创建F2分离群体,与之前构建的dcl1与野生型的F2群体共同进行矮化性状的基因定位,获得与卷叶相同的候选基因区间,通过KASP技术检测,BraA06g003880.3C在矮化F2群体中的性状与基因型相符。推测认为dcl1中植株矮小和卷叶的基因为同一个基因。
4.BraA06g003880.3C基因DNA全长1226bp,CDS序列全长914bp,包含一个典型的MYB结构域。在dcl1中第442位碱基由A变为G。这一突变发生在基因的选择性剪切位点,导致基因剪切发生错误,保留的内含子中含有终止子,基因的翻译存MYB结构域前终止。
5.根据叶片生长的不同时期进行转录组取样,叶片发育初期,GO富集得到类囊体膜、类囊体等光合作用相关的分类差异显著,KEGG富集结果显示,dcl1的光合途径中,PsbQ等基因下调表达。光合固碳途径涉及的酶类的编码基因转录水平下调。这可能导致叶片积累干物质的最减少。叶片生长后期,物质转运相关基因的转录水平发生明显变化。光合性能的损伤可能是dcl1植株显著变小的关键。
6.转录组取材的第二个时期在卷叶发生时期,这一时期生长素和脱落酸的合成和响应活跃,尤其是生长素合成YUCCA的上调,可导致生长素的累积。在生长素响应途径中富集到21个基因,有20个转录水平显著上调。喷施外源生长素之后大白菜叶片向下卷曲,对叶片喷施生长素转运抑制剂之后,叶片由直立变为平塌。因此,生长素的积累和转运可能是导致叶片卷曲的关键。
该研究为挖掘大白菜叶片卷曲和矮小的新型基因资源提供了良好的试验材料,也为进一步揭示大白菜叶片卷曲及矮小性状的分子调控机制奠定了基础。