【摘 要】
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丁二酮和乙偶姻是赋予奶酪奶香味的关键香气化合物,靶向内源提升丁二酮和乙偶姻含量是当前奶酪增香研究的重要方向,但关于乳酸菌生物合成丁二酮和乙偶姻的关键基因及其影响机制尚不明晰。基于此,本课题以切达奶酪为研究对象,首先利用基因工程手段对干酪乳杆菌TCS进行多基因共同表达构建重组菌株,研究不同重组干酪乳杆菌的发酵性能;其次,研究添加重组干酪乳杆菌的切达奶酪在不同成熟时间下风味物质的变化,以及关键基因的变
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丁二酮和乙偶姻是赋予奶酪奶香味的关键香气化合物,靶向内源提升丁二酮和乙偶姻含量是当前奶酪增香研究的重要方向,但关于乳酸菌生物合成丁二酮和乙偶姻的关键基因及其影响机制尚不明晰。基于此,本课题以切达奶酪为研究对象,首先利用基因工程手段对干酪乳杆菌TCS进行多基因共同表达构建重组菌株,研究不同重组干酪乳杆菌的发酵性能;其次,研究添加重组干酪乳杆菌的切达奶酪在不同成熟时间下风味物质的变化,以及关键基因的变化与丁二酮和乙偶姻含量的相关性。论文的主要结论如下:（1）根据乳酸菌合成丁二酮和乙偶姻的代谢途径,在敲除干酪乳杆菌TCS中alsD基因的基础上串联共表达nox和alsS基因。经过菌落验证和测序比对验证结果,成功构建TCS-△alsD-nox-alsS重组干酪乳杆菌。对所得的共表达重组菌进行蛋白诱导表达,诱导后的NOX和ALS两条蛋白条带明显。对重组菌的NADH氧化酶和α-乙酰乳酸合成酶的酶活进行测定,发现重组菌中两种酶活都比原始菌株高,共表达改造效果明显。（2）选择10株重组干酪乳杆菌和原始TCS菌,比较这11株干酪乳杆菌添加到切达奶酪对相关指标的影响,包括耐酸耐盐性、产酸能力、自溶度的影响。结果发现,11株干酪乳杆菌在低酸高盐的环境下均能生长,其产酸水平都相对较低,自溶度范围在20.31%-41.48%之间,各项指标都达到附属发酵剂的水平,均可用于后续切达奶酪的发酵制备。添加了11株不同干酪乳杆菌的切达奶酪样品在成熟第1天、2周、4周、6周、8周、12周下,可溶性氮含量均随切达奶酪成熟时间增加而增加。同时对切达奶酪成熟的6个时间点取样,利用GC-MS（gas chromatography-massspectrometry）检测其丁二酮和乙偶姻含量情况。在奶酪成熟的前8周,添加了10株重组菌的切达奶酪中丁二酮含量均大于添加原始菌株TCS的切达奶酪中丁二酮含量。在奶酪成熟的前12周中,添加了10株重组菌的切达奶酪中乙偶姻含量均大于添加TCS的乙偶姻含量。添加TCS-△alsD、TCSCnox、TCS-△alsD-nox-alsS三株重组菌的切达奶酪样品中丁二酮和乙偶姻含量相对最高。（3）对不同重组干酪乳杆菌生产的切达奶酪中挥发性化合物进行分析,共检测出60种挥发性物质,酮类物质和酸类物质含量整体上保持逐步递增趋势。当切达奶酪成熟至第十二周时,添加L.casei TCS-△alsD-nox-alsS的切达奶酪中风味物质种类最多且总含量也最高。从基因表达的结果分析,添加11株干酪乳杆菌的切达奶酪中,nox和alsS基因的表达呈先递增后递减趋势变化,且在成熟第6周时基因表达量最高。其中添加L.casei TCS-△alsD重组菌的奶酪在成熟第6周时,nox和alsS表达量均达到最高。针对两种物质含量与基因表达水平之间的相关性,切达奶酪成熟过程中不同时间点下丁二酮含量与nox和alsS表达量均呈显著正相关,其中在奶酪成熟第2、4、6、8周时,丁二酮含量与nox基因表达量呈极显著正相关（p＜0.01）,且丁二酮含量与nox相关性比alsS更高。除奶酪成熟第6周时乙偶姻含量与alsS基因表达量呈负相关以外,其他成熟时间下乙偶姻含量与nox和alsS基因表达量均呈正相关。
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