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甘油是酿酒酵母发酵生产乙醇过程中的一种主要副产物。它的生成因菌株、原料与发酵工艺等的不同会消耗约4%-10%的总碳源，而通过减少甘油的生成量可以提高乙醇的产量及原料的利用率。据估算在不增加其他成本的前提下，如果这些碳源全部转化为乙醇，可生产约13亿升的乙醇，这将会产生可观的经济效益。本研究通过敲除工业酿酒酵母甘油合成途径的关键酶基因GPD2，部分阻断其甘油的合成途径，以达到提高工业酿酒酵母的乙醇产率及原料利用率的目的。具体以二倍体的工业酿酒酵母AS2.489为出发菌，通过单倍体分别敲除目的基因，然后再通过单倍体融合的方法获得全敲除GPD2基因的二倍体菌株。本实验首先利用产孢培养基诱导出发菌株产生子囊孢子，然后采用孢子的群体分离方法筛选获得了5株单倍体。通过与标准单倍体菌株W303-1A进行杂交实验，鉴定出其中的1株为α型单倍体，另外4株为a型单倍体；此结果通过PCR扩增的方法得到进一步的验证。选择其中两株交配型不同的单倍体编号为AS-1（MATa）和AS-2（MATα）进行后续实验。单倍体GPD2基因的敲除基于DNA片段同源重组的原理进行。首先采用PCR法构建两端各有GPD2基因39bp同源序列的，以卡那霉素抗性基因为筛选标记的基因敲除组件。将敲除组件连接至pMD18-T Vector，转化大肠杆菌，阳性克隆经测序验证正确后，通过电转化方法将敲除组件分别导入单倍体细胞AS-1和AS-2内。基因敲除组件通过同源重组整合于酵母染色体上，利用卡那霉素抗性基因替换目的基因GPD2的全部编码区，分别筛选获得GPD2基因缺失的单倍体突变菌株AS-3（MATa gpd2Δ）和AS-4（MATα gpd2Δ）。最后将不同交配型的单倍体突变菌AS-3和AS-4进行杂交，所得突变株通过产孢法和PCR扩增方法进行鉴定，筛选获得完全缺失GPD2基因的二倍体突变菌株AS-5（MATa/αgpd2Δ/gpd2Δ）。通过葡萄糖发酵实验考察缺失GPD2基因对酵母生长状况及发酵能力的影响。以20g/L的葡萄糖进行摇瓶发酵实验，结果表明：与各自的初始野生型单倍体菌株相比，α型突变株AS-4和a型突变株AS-3的生长速率和葡萄糖消耗速率均慢于相应的野生型单倍体；而葡萄糖转甘油率则分别降低29.4%和23.01%，葡萄糖转乙醇率分别提高2.8%和2.1%。与工业酿酒酵母AS2.489（MATa/α）相比，二倍体突变菌AS-5的葡萄糖消耗速率慢于AS2.489，生物量相应的减少，而葡萄糖转甘油率降低了31.1%，葡萄糖转乙醇率提高了3.3%。本实验同时考察了发酵的次要副产物乙酸的产量，结果发现缺失GPD2基因的突变菌株与相应野生型菌株相比，乙酸产量都有所减少。本研究成功构建了缺失GPD2基因的单倍体和二倍体突变酿酒酵母菌，而且成功实现了降低甘油生成率和提高乙醇产率的目的。然而与各自所对应的出发菌相比，发现虽然副产物甘油和乙酸的产量确有下降，乙醇得率也有一定的提高，但GPD2基因敲除菌株的生长状况明显受到影响，导致葡萄糖消耗速率变慢，发酵周期延长，原因可能是甘油合成途径受阻而导致细胞质还原力NADH的积累。下一步可以尝试引入外源基因（如谷氨酸合酶基因GLT1等）的表达来改善突变菌株的生长状况。