研究背景血管内膜增生是指血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）和细胞外基质病理性地聚集于血管内膜的过程。这种血管重构往往发生在血管损伤之后,多种参与应答的细胞和循环成分被激活,对血管腔进行过度修复。诸多临床过程,如经皮冠状动脉介入术、外科冠状动脉旁路移植术中的静脉移植物、以及血液透析过程中的血管通路,都会带来不同程度的血管损伤,而修复的过程,又往往导致在这些治疗术后一年内出现血管腔再狭窄的现象。VSMCs在血管内膜增生的过程中扮演着十分重要的角色。当血管发生损伤后,被激活的炎性细胞和功能紊乱的内皮细胞释放出大量的活性因子,如血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）,促进平滑肌细胞的增殖,进而促进其从血管中膜向血管内膜迁移沉积,形成病理性的增生内膜。既往研究表明,内膜增生的过程受到一系列因子的调控,其中包括信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）。当 VSMCs 受到细胞因子或生长因子的刺激,STAT3被磷酸化,并以磷酸二聚体的形式从细胞质转移至细胞核中,调控包括增殖和迁移在内的相关靶基因的表达。干扰STAT3基因或采用STAT3抑制剂均可抑制VSMCs的增殖和迁移,进而减轻血管内膜增生的程度。尽管STAT3能够促进血管内膜增生的作用已经明确,但是在此病理过程中,STAT3的表达和功能如何被调控还需更深层的研究。果蝇幼虫巨大致死基因1（lethal giant larvae 1,LGL1）因首次发现于果蝇中而得名,该基因可以编码一系列高度保守的蛋白。在既往研究中,LGL1对于维持细胞的极性和稳定性有着重要的作用;此外,它还能够作为肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。在我们近期的研究中,LGL1能够通过高迁移率族蛋白B1抑制血管钙化。然而,LGL1在血管损伤导致的内膜增生中发挥的作用,还未有研究阐述。因此,本研究采用平滑肌特异性敲除LGL1（LGL1SMKO）小鼠探究LGL1在血管内膜增生过程中的作用,并探索其具体机制,为寻找血管损伤后重塑的可能干预靶点提供新的思路。论文I LGL1在平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制研究研究目的1.明确病理性增殖刺激下VSMCs中LGL1的表达变化;2.探究LGL1对VSMCs增殖和迁移功能的影响;3.探讨LGL1调控VSMCs增殖和迁移的具体作用机制。研究方法1.小鼠原代主动脉VSMCs的提取和鉴定采用LGL1flox/flox小鼠与α-SMA启动子调控的Cre（α-SMA-Cre）小鼠杂交,繁育平滑肌特异性LGL1敲除小鼠,即LGL1SMKO小鼠。同窝出生的LGL1flox/flox/Cre-小鼠作为对照组（control,CTR）。选取4-6周龄小鼠,用组织块贴壁法提取小鼠原代主动脉VSMCs,并采用细胞免疫荧光技术检测平滑肌细胞标志物（SM22α、α-SMA）在所提取细胞中的表达。2.探究病理性增殖刺激下VSMCs中LGL1的表达变化使用 20ng/mL PDGF-BB 对 VSMCs 进行 0h、12h、24h、48h 和 72h 的时间梯度刺激,Western Blot和qRT-PCR分别检测LGL1蛋白和mRNA含量。3.探究LGL1过表达对VSMCs增殖和迁移功能的影响培养VSMCs,分别感染LGL1过表达腺病毒和GFP腺病毒,后用PDGF-BB（20ng/mL）和等剂量Vehicle（PBS）作为对照刺激VSMCs48h。细胞分为以下4组:① GFP+Vehicle;② LGL1+Vehicle;③GFP+PDGF-BB;④ LGL1+PDGF-BB。Western Blot和qRT-PCR分别检测细胞周期相关分子Cyclin D1和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）蛋白及 mRNA 水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。4.探究LGL1缺失对VSMCs增殖和迁移功能的影响对CTR和LGL1SMKO组原代VSMCs给予PDGF-BB（20ng/mL）和等剂量Vehicle（PBS）作为对照刺激48h。细胞分为以下4组:①CTR+Vehicle;②LGL1SMKO+Vehicle;③ CTR+PDGF-BB;④ LGL1SMKO+PDGF-BB。WesternBlot和qRT-PCR分别检测增殖相关分子Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。5.探究LGL1对STAT3的调节作用在 VSMCs 中过表达 LGL1,Western Blot 检测 STAT3 和 P-STAT3（Y705）的蛋白含量;qRT-PCR检测STAT3的mRNA水平;免疫共沉淀实验明确LGL1是否能与STAT3结合;应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）、溶酶体酶抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）和蛋白酶体抑制剂MG132进行蛋白质降解途径实验,确定LGL1通过何种方式影响STAT3的降解。6.探究STAT3在LGL1调控VSMCs增殖和迁移中的作用对 CTR 和 LGL1SMKO 原代 VSMCs 使用 STAT3 抑制剂 SH-4-54（10μM）及其等剂量Vehicle（DMSO）预处理24h,再加入PDGF-BB（20ng/mL）及其等剂量 Vehicle（PBS）刺激 48h。细胞分为以下 8 组:①CTR+Vehicle+Vehicle;②LGL1SMKO+Vehicle+Vehicle;③CTR+Vehicle+SH-4-54;④ LGL1SMKO+Vehicle+SH-4-54;⑤ CTR+PDGF-BB+Vehicle;⑥ LGL1SMKO+PDGF-BB+Vehicle;⑦ CTR+PDGF-BB+SH-4-54;⑧ LGL1SMKO+ PDGF-BB+SH-4-54。Western Blot和qRT-PCR分别检测增殖相关分子Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。7.统计学分析所有计量数据均以均数±标准误（mean±SEM）的形式表示。采用Klomogorov-Smirnov检验对计量数据进行正态性检验;采用非配对Student t检验进行两组间的比较;采用单因素方差分析对单变量引起的多组间差异进行比较,并采用Bonferroni事后检验进行两两对比。P＜0.05被视为有统计学差异。研究结果1.PDGF-BB抑制VSMCs中LGL1的表达Western Blot和qRT-PCR检测在PDGF-BB时间梯度刺激下VSMCs中LGL1的表达量。结果表明,在PDGF-BB的作用下,VSMCs中LGL1的蛋白和mRNA水平均呈下降趋势,且含量随PDGF-BB作用时间的增加而降低。2.LGL1过表达抑制VSMCs的增殖和迁移Western Blot和qRT-PCR结果显示,PDGF-BB可以增加细胞增殖标志物Cyclin D1和PCNA的蛋白和mRNA表达,而过表达LGL1可抑制Cyclin D1和PCNA的蛋白和mRNA表达水平的上调。CCK-8法检测结果表明LGL1过表达能够抑制VSMCs的增殖能力。此外,伤口愈合实验结果证明,LGL1过表达可以显著抑制VSMCs的迁移能力。3.LGL1敲除促进VSMCs的增殖和迁移与CTR组相比,LGL1SMKO组VSMCs中Cyclin D1和PCNA的蛋白及mRNA含量均上调,LGL1缺失加剧了 PDGF-BB引起的细胞周期相关因子表达水平的升高。细胞增殖实验和伤口愈合实验的结果分别表明了 LGL1敲除能够促进VSMCs的增殖能力和迁移能力。4.LGL1能够与STAT3结合并促进其降解Western Blot和qRT-PCR结果显示,VSMCs过表达LGL1可下调STAT3和P-STAT3（Y705）的蛋白含量,但不影响STAT3的mRNA水平。免疫共沉淀结果表明,LGL1能够与STAT3结合。蛋白酶体抑制剂MG132可显著抑制LGL1过表达引起的STAT3蛋白水平下调,而自噬抑制剂3-MA或溶酶体酶抑制剂CQ则不能引起这种改变,说明LGL1通过蛋白酶体途径促进了 STAT3的降解。5.LGL1通过STAT3抑制VSMCs的增殖和迁移Western Blot和qRT-PCR结果表明,STAT3抑制剂SH-4-54能够抑制LGL1敲除引起的VSMCs中Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA表达量的增加。CCK-8检测显示,SH-4-54能够抑制LGL1敲除引起的VSMCs增殖能力的增强。而伤口愈合实验的结果则证实SH-4-54能显著减弱LGL1敲除引起的VSMCs迁移能力的增强。以上结果说明,LGL1通过STAT3抑制VSMCs的增殖和迁移。结论1.PDGF-BB抑制VSMCs中LGL1的表达水平;2.在VSMCs中过表达LGL1,能降低细胞周期相关蛋白的表达,抑制平滑肌细胞的增殖和迁移功能;3.在VSMCs中敲除LGL1,可增加细胞周期相关蛋白的表达,促进平滑肌细胞的增殖和迁移功能;4.LGL1减少STAT3蛋白含量而不影响STAT3 mRNA水平,该作用是通过与STAT3结合,并经由蛋白酶体途径促进后者降解;5.在VSMCs中抑制STAT3,可明显减弱由LGL1缺失引起的平滑肌细胞增殖和迁移功能的增强。论文Ⅱ LGL1在小鼠血管内膜增生模型中的作用及机制研究研究目的1.在体内明确血管损伤后重塑过程中LGL1的表达变化;2.探究血管平滑肌LGL1对血管内膜增生的影响;3.在体内验证血管平滑肌LGL1调控血管内膜增生的具体机制。研究方法1.小鼠血管内膜增生模型构建采用LGL1flox/flox小鼠与α-SMA启动子调控的Cre（α-SMA-Cre）小鼠杂交,繁育平滑肌特异性LGL1敲除小鼠,即LGL1SMKO小鼠。同窝出生的LGL1flox/flox/Cre-小鼠作为对照组（control,CTR）。通过免疫荧光共定位染色（α-SMA,LGL1）鉴定小鼠血管中平滑肌LGL1基因表达。8周龄小鼠通过左颈总动脉（left common carotid artery,LCCA）结扎术构建血管内膜增生模型,记为Ligated。右侧颈总动脉（right common carotid artery,RCCA）除结扎外与左侧颈总动脉做相同处理,作为自体对照（Sham）。术后正常喂养3周后取材。2.探究血管内膜增生过程中血管LGL1表达的变化对8周龄野生型小鼠进行LCCA结扎术造模,RCCA为对照,3周后取材。Western Blot和免疫组织化学染色检测结扎组和未结扎组中LGL1的蛋白表达变化,qRT-PCR检测两组中LGL1的mRNA含量变化。实验分为Sham组和Ligated组。3.探究血管平滑肌LGL1在小鼠血管内膜增生中的作用对8周龄CTR小鼠和LGL1SMKO小鼠进行LCCA结扎术造模,RCCA为对照,3周后取材。Western Blot和免疫组织化学染色检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1和PCNA的变化。对颈总动脉横切面行HE染色观察血管内膜增生的程度。实验分组如下:①CTR+Sham 组;②LGL1SMKO+Sham 组;③CTR+Ligated组;④LGL1SMKO+Ligated 组。4.验证LGL1通过STAT3抑制小鼠血管内膜增生对8周龄CTR小鼠和LGL1SMKO小鼠进行LCCA造模,RCCA为对照,同时腹腔注射STAT3抑制剂SH-4-54（10mg/Kg/天）或等剂量Vehicle,3周后取材。对颈总动脉横切面行HE染色观察血管内膜增生的程度。实验分组如下:①CTR+Vehicle+Sham 组;② LGL1SMKO+Vehicle+Sham 组;③ CTR+SH-4-54+Sham 组;④LGLlSMKO+SH-4-54+Sham 组;⑤CTR+Vehicle+Ligated 组;⑥LGL1SMKO+Vehicle+Ligated 组;⑦CTR+SH-4-54+Ligated 组;⑧LGL1SMKO+SH-4-54+Ligated 组。5.统计学分析同论文Ⅰ。研究结果1.血管内膜增生过程中LGL1表达下降Western Blot和qRT-PCR结果显示,与Sham组相比,Ligated组的LGL1蛋白及mRNA含量均降低。免疫组织化学染色检测结果亦表明血管内膜增生过程中LGL1表达下降。2.平滑肌细胞特异性敲除LGL1促进血管内膜增生Western Blot和免疫组织化学染色检测结果表明,与Sham组相比,Ligated组的血管Cyclin D1和PCNA的蛋白表达量均明显升高,而平滑肌特异性敲除LGL1进一步促进了血管内膜增生过程中细胞周期相关蛋白的表达上调。HE染色结果显示LGL1SMKO组相较于CTR组,病理性血管增生内膜面积显著增加,内膜中膜比显著上升。3.LGL1通过STAT3抑制小鼠血管内膜增生通过HE染色显示颈总动脉形态学变化和内膜增生情况,结果显示,与Vehicle组相比,给予STAT3抑制剂SH-4-54注射的小鼠血管增生内膜面积和内膜中膜比显著减少,SH-4-54能够显著缓解由平滑肌LGL1缺失引起的小鼠血管内膜增生病变。结论1.小鼠血管内膜增生过程中血管LGL1蛋白和mRNA的表达水平下降;2.平滑肌特异性敲除LGL1能够促进损伤后血管内膜增生和管腔再狭窄;3.LGL1通过STAT3调控血管内膜增生过程,在小鼠体内应用STAT3抑制剂可明显减轻由LGL1SMKO引起的血管内膜增生和重塑。