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目的本实验以C57BL/6J自然衰老小鼠为研究对象,通过使用六味地黄丸治疗C57BL/6J自然衰老小鼠,并观察衰老模型小鼠脑部海马组织中蛋白质组学的差异及其相关蛋白变化对记忆学习能力的影响,研究六味地黄丸对于C57BL/6J自然衰老小鼠的神经保护作用及其潜在的治疗靶点与可能的分子生物学机制,为临床治疗脑衰老引起的相关神经退行性疾病提供一定的理论和实验依据。方法1.实验分组及用药:选取3月龄雄性C57BL/6J小鼠15只为正常组,20月龄雄性C57BL/6J小鼠45只随机分为三组:（1）正常组:3月龄雄性C57BL/6J小鼠15只,给予生理盐水;（2）模型组:20月龄雄性C57BL/6J小鼠15只,给予生理盐水;（3）六味治疗组:20月龄雄性C57BL/6J小鼠15只,给予六味地黄丸悬浮液;（4）阳性对照组:20月龄雄性C57BL/6J小鼠15只,给予盐酸多奈哌齐悬浮液。采取每日固定时间灌胃给药一次的方式,连续给药周期为2个月。2.行为学实验（Morris水迷宫,Y迷宫,旷场）观察小鼠行为学变化。3.蛋白质组学筛选分析,为后续实验提供基础。4.透射电子显微镜观察小鼠海马区神经元周围线粒体数量以及形态变化。5.免疫组织荧光化学方法检测小鼠海马区ROS表达情况。6.免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测小鼠海马部分NNT、Nrf2、HO-1、NQO1、Mfn2、Drp1、OPA1蛋白表达含量。结果1.行为学实验:Morris水迷宫定位航行实验结果显示:各组小鼠逃避潜伏期与训练时间成反比,随着训练时间增长,逃避潜伏期逐渐缩短。与正常组比较,模型组在第3天出现统计学差异,在第5天逃避潜伏期明显增加,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）;与模型组比较,六味治疗组和阳性对照组逃避潜伏期在第5天缩短,两组与模型组之间具有统计学差异（P＜0.05）。空间探索实验结果显示:与正常组比较,模型组目标象限停留时间百分比下降,穿越平台次数减少,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）;与模型组比较,六味治疗组和阳性对照组在目标象限停留时间百分比增加,穿越平台次数增高,两组与模型组之间具有统计学差异（P＜0.05）。Y迷宫实验结果显示:各组移动总距离并无明显差异,与正常组比较,模型组自发交替准确率下降,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）;与模型组比较,六味治疗组和阳性对照组自发交替准确率全都有所提高,两组与模型组之间具有统计学差异（P＜0.05）。旷场实验结果显示:各个小组在自发探索总距离中无明显差别,在理毛次数总时间中,与正常组比较,模型组理毛次数总时间明显降低,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）;与模型组相比,六味治疗组理毛次数总时间增长,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）。2.蛋白质组学实验结果显示:与正常组相比较,模型组中上调差异蛋白有138个,下降差异蛋白有90个,经过GO（Gene Ontology,GO）富集分析差异蛋白在生物过程中主要富集在神经系统发育;中枢神经系统发育;离子转运调控突触传递;细胞黏附调节;细胞吞噬;细胞对钙离子反应;蛋白质活化级联反应调节多细胞免疫反应;B细胞介导免疫反应;细胞坏死等方面。差异蛋白在细胞组分中主要富集在躯体神经元投射;树突束;树突;轴突;细胞外区域细胞体;核糖体以及胞质大核糖体亚基等方面。差异蛋白在分子功能中主要富集在神经递质结合;结构分子活动;肌动蛋白丝结合;G蛋白偶联受体活性补体成分C1q复合物结合,髓鞘清道夫受体活性结构成分,免疫球蛋白受体结合,钙调节蛋白结合等方面。与模型组相比较,六味治疗组中上调差异蛋白91个,其中10个经过治疗回调至正常组水平。下调差异蛋白12个,其中8个经过治疗差异蛋白回调至正常组水平。其中所筛选关键蛋白NNT与氧化应激和线粒体皆具有相关性。3.透射电子显微镜实验:电镜下观察小鼠海马神经元周围线粒体数量与结构,可见正常组神经元周围线粒体分布均匀,结构清晰,双膜可见;模型组神经元结构异常的线粒体增多,双层膜结构溶解,内嵴破坏,有堆积形成的髓样小体。与模型组比较,六味治疗组和阳性对照组正常线粒体数量增多,且大多数线粒体与核膜结构比较完整。4.Western Blot实验:与正常组比较,模型组HO-1、Nrf2、NQO1、Mfn2、Drp1表达增加,NNT、OPA1表达减少,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）;与模型组比较,六味治疗组和阳性对照组HO-1、Nrf2、NQO1、Mfn2、Drp1表达有所降低,NNT、OPA1表达增加,两组之间具有统计学差异（P＜0.05）。结论1.六味地黄丸能够改善自然衰老模型小鼠的学习记忆能力和焦虑情绪。2.通过蛋白质组学分析自然衰老小鼠与正常小鼠脑部差异蛋白富集,并提出NNT是预防和治疗脑衰老引起的神经退行性病变的潜在靶点。3.六味地黄丸能够减少活性氧的产生,激活其内源性抗氧化通路,减轻脑内氧化应激损伤,缓解脑内神经炎症的产生。4.六味地黄丸能够改善线粒体形态和线粒体动力学平衡,减轻线粒体损伤,从而对神经元具有一定保护作用。