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背景:高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病往往以血管内皮细胞功能障碍为主要病理学特征,其发生和发展与炎症反应密切相关。血管紧张素II（Angiotensin II,Ang Ⅱ）是导致多种心血管疾病的最主要的病理活性物质,其常通过炎症反应所介导的病理生理学机制诱发和促进与炎症反应相关的心血管疾病的发生和发展。研究发现磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）/内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）信号通路与炎症反应密切相关,其通过促进机体组织一氧化氮（Nitric oxide,NO）的产生,从而抑制炎症反应。黄芪甲苷（Astragaloside IV,AS-Ⅳ）是中药黄芪的主要成分,其抗炎作用已得到大量研究证实,并得到广泛认可。因此,本研究拟探明AS-Ⅳ对Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞介导的炎症反应的影响,以及Ca2+/PI3K/Akt/e NOS信号通路在此过程中的作用,从而为AS-Ⅳ的临床应用奠定药理学实验基础。目的:通过人脐静脉血管内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）培养模型,探明AS-Ⅳ对Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞介导的炎症反应的影响,以及Ca2+/PI3K/Akt/e NOS信号通路在此过程中的作用,从而进一步阐明AS-Ⅳ抑制Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞介导的炎症反应的分子生物学机制。方法:1.细胞培养:在37℃、5%CO2条件下,用含10%FBS的DMEM完全培养基常规培养HUVECs细胞,每隔24 h,细胞进行换液,每隔48 h细胞进行传代。将培养至3-7代细胞用于后续实验处理。待细胞密度达80%以上后,换用不含血清的DMEM培养基培养4 h后,进行分组实验处理。2.实验处理及分组2.1实验一:探明AS-Ⅳ对血管内皮细胞产生NO和表达磷酸化e NOS的影响。（1）探明AS-Ⅳ对血管内皮细胞产生NO的影响。实验分组:（1）空白对照组;（2）不同剂量AS-Ⅳ（0-30μmol/L）处理组;（3）AS-Ⅳ（30μmol/L）处理不同时间（0-12 h）组;（4）L-NMMA（特异性NOS抑制剂,1 mmol/L）+AS-Ⅳ（30μmol/L）组;（5）LY294002（PI3K/Akt抑制剂,10μmol/L）+AS-Ⅳ（30μmol/L）组;（6）EGTA(Ca2+螯合剂,500 nmol/L)+AS-Ⅳ（30μmol/L）组。（2）探明AS-Ⅳ对血管内皮细胞表达磷酸化e NOS蛋白量的影响。实验分组:（1）空白对照组;（2）AS-Ⅳ（30μmol/L）处理不同时间（0-80 min）组;（3）LY294002（PI3K/Akt抑制剂,10μmol/L）+AS-Ⅳ（30μmol/L）组;（4）EGTA(Ca2+螯合剂,500 nmol/L)+AS-Ⅳ（30μmol/L）组。2.2实验二:探明AS-Ⅳ对Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞炎症反应的影响,以及Ca2+/PI3K/Akt/e NOS信号通路在该过程中的作用。实验分组:（1）空白对照组;（2）Ang Ⅱ（1μmol/L）组;（3）AS-Ⅳ（30μmol/L）+Ang Ⅱ（1μmol/L）组;（4）L-NMMA（特异性NOS抑制剂,1 mmol/L）+AS-Ⅳ（30μmol/L）+Ang Ⅱ（1μmol/L）组;（5）LY294002（PI3K/Akt抑制剂,10μmol/L）+AS-Ⅳ（30μmol/L）+Ang Ⅱ（1μmol/L）组;（6）EGTA(Ca2+螯合剂,500 nmol/L)+AS-Ⅳ（30μmol/L）+Ang Ⅱ（1μmol/L）组。3.指标检测:一步法测定血管内皮细胞NO含量;Western blot法检测细胞磷酸化e NOS（ser1177）蛋白含量;细胞酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子（TNF-α、IL-6）、趋化因子（MCP-1）水平;基于细胞酶联免疫吸附法（Cell-based ELISA）检测细胞黏附因子（ICAM-1、VCAM-1）及磷酸化IκBα蛋白含量;检测CFSE荧光标记的THP-1细胞粘附于HUVECs的能力;基于ELISA法测定细胞核转录因子NF-κB活性。结果:1.与空白对照组相比,AS-Ⅳ明显促进HUVECs产生NO,并且呈剂量依赖性（P＜0.05）,对于AS-Ⅳ处理组,NO的产生随AS-Ⅳ干预的时间增加而增多（P＜0.05）,且AS-Ⅳ的促进作用可被L-NMMA（特异性NOS阻断剂）、LY294002（PI3K/Akt抑制剂）或EGTA(Ca2+螯合剂)所阻断（P＜0.05）。2.与空白对照组相比,AS-Ⅳ促进HUVECs中磷酸化e NOS（ser1177）蛋白含量的升高,且在40 min时促进作用最显著（P＜0.05）,而AS-Ⅳ的促进作用可被LY294002（PI3K/Akt抑制剂）或EGTA(Ca2+螯合剂)所阻断（P＜0.05）。3.与空白对照组相比,Ang Ⅱ处理诱发HUVECs产生和表达细胞因子（TNF-α、IL-6）、趋化因子（MCP-1）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）,并增加单核细胞THP-1粘附于HUVECs的数量（P＜0.05）,而AS-Ⅳ可抑制Ang Ⅱ的作用（P＜0.05）。另外,AS-Ⅳ的抑制作用可被L-NMMA（特异性NOS抑制剂）、LY294002（PI3K/Akt抑制剂）或EGTA(Ca2+螯合剂)所阻断（P＜0.05）;4.与空白对照组相比,Ang Ⅱ处理明显促进HUVECs中磷酸化蛋白IκBα含量的升高（P＜0.05）,并增强NF-κB结合活性（P＜0.05）,而AS-Ⅳ可抑制Ang Ⅱ的作用（P＜0.05）。另外,AS-Ⅳ的抑制作用可被L-NMMA（特异性NOS抑制剂）、LY294002（PI3K/Akt抑制剂）或EGTA(Ca2+螯合剂)所阻断（P＜0.05）。结论:1.通过HUVECs培养模型,本研究发现和证实AS-Ⅳ通过激活Ca2+/PI3K/Akt/e NOS信号通路促进血管内皮细胞NO的产生。2.通过HUVECs培养模型,本研究发现和证实AS-Ⅳ可抑制Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞介导的炎症反应。3.通过HUVECs培养模型,本研究进一步发现和证实,AS-Ⅳ通过激活Ca2+/PI3K/Akt/e NOS/NO信号通路抑制Ang Ⅱ所诱发的血管内皮细胞介导的炎症反应。