【摘 要】
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松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)不仅是松材线虫病的主要传播媒介,还能通过幼虫期在韧皮部和木质部钻蛀危害造成松树衰弱甚至死亡。不同龄期幼虫的食物来源-木质纤维素的组分会发生变化,这一取食特性是否对松墨天牛幼虫肠道细菌多样性及其纤维素降解功能存在影响,目前鲜有报道,值得深入研究。本文采用宏基因组学,离体培养、酶学测定和细菌全基因组学的技术手段,对不同龄期松墨天牛幼虫肠道
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松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)不仅是松材线虫病的主要传播媒介,还能通过幼虫期在韧皮部和木质部钻蛀危害造成松树衰弱甚至死亡。不同龄期幼虫的食物来源-木质纤维素的组分会发生变化,这一取食特性是否对松墨天牛幼虫肠道细菌多样性及其纤维素降解功能存在影响,目前鲜有报道,值得深入研究。本文采用宏基因组学,离体培养、酶学测定和细菌全基因组学的技术手段,对不同龄期松墨天牛幼虫肠道细菌多样性及其纤维素酶解功能进行研究,主要得出以下结论:1.取食韧皮部的低龄幼虫的肠道细菌群落多样性显著高于取食木质部的高龄幼虫;这些肠道细菌分别属于多个科,其中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌相对丰度最高;在幼虫发育的5个龄期中,肠道优势菌属相对丰度存在差异,欧文氏菌(Erwinia)在1龄(58.3%±3.7%)和5龄(82.0%±16.9%)幼虫肠道中均为丰度最高的细菌,肠杆菌(Enterobacter)在 3 龄(97.1%±2.3%)、4 龄(49.2%±14.2%)和2龄(31.7%±20.1%)幼虫肠道中为主要优势菌。本研究首次在松墨天牛肠道中发现了放线菌(Actinomycetes),其中纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)属于放线菌门(Actinobacteria)是1龄幼虫中丰度第二的优势菌科(10.6%)。2.从松墨天牛幼虫肠道中共分离获得51株纤维素降解菌,分别隶属于4个菌门,包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门,9个菌科,10个菌属,11个菌种。其中蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株BS16在CMC定性测定中表现为纤维素酶活性最高的细菌(菌落透明圈直径与菌落直径比为2.72)。BS16在培养2d、5 d和7 d时的滤纸降解率分别为10.71%、17.45%和24.31%。BS16所产生酶量较多,纤维素酶活性较好,纤维素酶活结果表明,内切葡聚糖酶活最高(57.48±0.738 U/mL),外切纤维素酶活为49.62±0.752 U/mL,β-葡萄糖苷酶活为27.02±0.845 U/mL,因此蜡样芽孢杆菌BS16菌株具有完整的纤维素酶活体系。3.蜡样芽孢杆菌BS16全基因组大小为5,347,914bp,基因总数目为5494个,基因组中所有基因序列的总GC含量为35.87%,基因平均长度820 bp,含有的tRNA编码基因数为102个,rRNA的编码基因为1 1个,sRNA编码基因为17个。根据GO数据库比对,预测含2036个存在催化活性的功能基因。比对COG数据库注释,预测到25个功能类别,总功能基因数目为4402个(80.16%),其中被归类到预测功能,氨基酸转运与代谢,转录和糖类转运和代谢功能的编码基因数目分别是437个、411个、373个和276个。通过CAZy数据库分类比对,预测蜡样芽孢杆菌BS16全基因组序列中含有与糖苷水解家族(5个GHs)、辅助酶类家族(1个AAs)和碳水化合物结合模块(8个CBMs)相关的参与纤维素降解完整酶系的编码基因。这些家族包含有β-葡萄糖苷酶GH4(EC 3.2.1.86)基因1个,外切葡聚糖酶GH5(EC 3.2.1.91)基因1个,内切葡聚糖酶GH8(EC3.2.1.4)基因1个,木聚糖酶GH10(EC 3.2.1.8)基因1个,几丁质酶GH18(EC 3.2.1.14)基因4个,裂解多糖单氧化酶AA10(EC 1.14.99.54)基因3个及碳水化合物结合模块CBMs基因38个,该结果从基因层面揭示了蜡样芽孢杆菌BS16的纤维素降解功能和作用机制。
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