本论文包括两部分：第一部分工作包括蛋白酶体激活因子PA200原核表达载体的构建，及PA200在生精过程中功能的初步探索；第二部分工作主要进行了新的蛋白酶体亚单位hRpn13的蛋白纯化。 精子发生是一个高度有序的过程，在这一过程中蛋白质成分和水平均发生显著改变，而泛素—蛋白酶体通路在其中发挥重要调控作用。该通路是一种高效的、有选择性的蛋白质降解途径，在细胞周期调控、抗原提呈、转录调节等各方面发挥作用。真核细胞26S蛋白酶体包括20S核心催化亚单位和19S调节亚单位。其它已知的调节亚单位还有PA28和PA200，其中PA200是最新发现的一个。 PA200基因又名PSME4，其在哺乳动物中高度保守。Rechsteiner等人从牛睾丸中纯化得到PA200，并制备了其抗体。用此抗体进行的Western检测发现PA200有三种形式，其分子量大小分别为200kDa、160kDa和60kDa。它们广泛分布于小鼠各组织中，其中200kDa蛋白在睾丸中含量最高。目前对PA200生物学功能的研究证实其为20S的激活因子，但它是否在DNA修复中发挥作用还存在争议。此外S1eckman等人通过基因敲除的方法得到了PA200△/△小鼠，除雄性生殖能力显著下降外，无其它显著异常；对睾丸和附睾的组织切片进行观察，发现生精过程中减数分裂的精母细胞存在形态异常，同时减数分裂后单倍体精子细胞成熟存在障碍。 实验中构建了PA200的200kDa和60kDa两种原核表达载体，并尝试对其进行表达。同时还用BLAST和外显子预测的方法对已知剪接体进行了分析，结果提示已知的PA200全长可能并不完全，以人睾丸cDNA文库为模板进行的扩增证实了上述预测。此外还用RNA干扰和免疫荧光的方法初步研究了PA200在生精过程中的作用。其中，RNA干扰质粒已构建成功，转染小鼠精原干细胞和精母细胞的工作正在进行中。而对小鼠睾丸、附睾冰冻切片进行的免疫荧光结果提示PA200同时存在于体细胞和生精细胞的细胞核中，特别是其在圆形精子细胞和成熟精子中的高表达值得关注。 同时，泛素—蛋白酶体通路中泛素化与去泛素化对于维持生物体内蛋白质功能也起着至关重要的作用，第二部分工作研究对象hRpn13就在去泛素化中发挥功能。该部分在本组邱小波教授的前期工作基础上开展。在亲和层析法纯化蛋白酶体的过程中，他发现了一个新的407个氨基酸的蛋白质，因其N端与酵母Daq1/Rpn13有27.6％的同源性，故将其命名为hRpn13。其在真核生物中高度保守，并在小鼠各组织中广泛表达。前期实验结果表明hRpn13存在于蛋白酶体亚单位19S中，通过其N端与蛋白酶体连接，而其C端直接与去泛素化酶UCH37结合，并能促进其异肽酶活性，在蛋白降解过程中发挥作用。尽管有以上发现，还希望通过结构生物学的相关信息为进一步研究hRpn13功能提供线索，并为将来的应用前景积累资料。对已经成功构建的C端带有His6标记的表达hRpn13全长或部分序列的质粒载体进行了表达纯化，其纯化蛋白在质及量方面均达到了晶体分析的要求，目前后续工作正在进行中。