大肠杆菌是寄居在人和温血动物肠道中的正常菌群之一，大部分为非致病性菌株，然而少数具有致病性。致病性大肠杆菌可分为两大类:肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)。禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E.coli，APEC)属于ExPEC的成员，定植于肠道外，能够引起禽的局部或全身感染性疾病-大肠杆菌病。禽大肠杆菌病已成为最严重的细菌性传染病之一，给全世界养禽业造成了重大的经济损失。已发现APEC具有多种致病因子，且新的致病因子在不断地被研究发现。基因突变的方法是研究基因功能的主要手段。λRed重组系统广泛应用于大肠杆菌基因突变株的构建，该系统的简便、高效为我们研究APEC目标基因提供了方便。　　本研究运用λRed重组系统构建了APEC优势血清型O2 E058菌株GI22基因组岛、tmRNA-SmpB系统、neuC和ompT基因缺失突变株，探讨其与致病性之间的关系，进而对突变株抗性去除前后致病作用改变的分子机制进行探讨，旨在了解禽致病性大肠杆菌的致病机制及加深对λRed重组系统的认识，为深入研究APEC的致病机理及评价潜在致病基因的致病力奠定基础。　　1.运用λRed重组系统构建APEC tmRNA-SmpB系统突变株及其致病性分析　　以高致病株APEC O2 E058为研究对象，通过基因克隆、测序、比对的方法，确定GI22基因组岛存在于APEC E058株中，并对GI22基因组岛进行序列分析和定位。进而，运用λRed重组的方法成功构建了GI22全基因组岛突变株E058△GI22-I。1日龄SPF仔鸡及35日龄SPF鸡体内定植与持续试验结果显示，突变株较野生株的致病力显著降低。相关的研究结果及进一步研究表明，ssrA是GI22基因组岛的整合位点，ssrA和其邻近基因smpB组成tmRNA-SmpB系统，该系统或许与E058△GI22-I基因组岛突变株致病力降低有关。　　运用λRed重组系统，成功构建了APEC E058△smpB，E058△ssrA和E058△smpB△ssrA基因缺失突变株，同时构建了双基因突变株的回复株ReE058△smpB△ssrA。SPF鸡致死性试验及定植与持续性感染试验结果均表明，破坏smpB或ssrA和同时破坏这两个基因，均可以显著降低APEC E058的致病力，且回复株的致病力能够得到显著回复。鸡巨噬细胞HD-11感染试验结果表明，突变株在HD11内增殖和/或存活的能力降低。组织病理学结果表明，野生株感染组鸡的脏器病变程度较E058△smpB，E058△ssrA及双基因突变株感染组更为严重，而回复株感染组鸡的脏器病变程度与野生株感染组相似。同时，荧光定量PCR试验结果显示，E058△smpB△ssrA突变株中转录调控基因rfaH，毒力基因kpsM、chuA和iss的表达水平较野生株显著下调。然而，体外试验结果显示，突变株与野生株在抵抗SPF鸡血清补体杀菌、HD-11细胞吞噬、及在37℃和42℃的LB培养基中的生长情况等方面均没有显著差异。这些数据表明，tmRNA-SmpB系统对APEC O2 E058株的致病性是至关重要的。　　2.λRed重组系统引入抗性去除前后APEC tmRNA-SmpB系统，neuC和ompT突变株致病作用的研究　　λRed重组系统广泛应用于大肠杆菌基因功能的研究，该系统的简便、高效为我们研究APEC的目标基因提供了方便。然而，本实验室研究发现，neuC有抗与无抗突变株之间在致病性方面存在差异。针对这一现象，本研究选取了tmRNA-SmpB系统，neuC和ompT三种不同功能的基因进行了进一步的研究。　　本研究中，我们将E058△ssrA、E058△smpB△ssrA、E058△tmRNA-SmpB、E058△neuC和E058△ompT突变株中的cat抗性去除，RT-PCR试验结果显示，所有有抗突变株中原基因与cat抗性之间形成的重组片段均不能正常转录，而抗性去除后产生的重组片段ssrA、tmRNA-SmpB、neuC和omp T均可正常转录。且无抗突变株E058△smpB△ssrA中产生的smpB-kan片段依然不能正常转录。1日龄SPF鸡致死性试验及35日龄SPF鸡体内定植与持续试验结果均表明，tmRNA-SmpB系统无抗突变株较其有抗突变株相比，致病力没有表现出显著差异。　　1日龄SPF鸡致死性试验及35日龄SPF鸡体内定植与持续试验结果均表明，较野生株E058相比，新突变的E058△neuC有抗突变株致病力极显著降低，且回复株ReE058△neuC的致病力能够得到显著回复。同时，与有抗突变株E058△neuC相比，无抗突变株E058△neuC在SPF鸡的肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的定植及感染能力增强。体内定植与持续试验结果表明，较野生株相比，ompT基因突变株的定植能力显著降低，且回复株ReE058△ompT的致病力与野生株相当。SPF鸡感染模型表明，在感染鸡的各个脏器中，无抗突变株E058△ompT的致病力较有抗突变株E058△ompT极显著放大。　　以上研究结果表明，tmRNA-SmpB系统，neuC和ompT基因均与APEC E058株的致病性高度相关。同时，运用λRed重组系统构建的有抗突变株，其抗性的去除与否对APEC突变株的致病性评价产生影响。　　3.APEC neuC和ompT突变株抗性去除后致病作用改变的初步机制研究　　根据第二章内容，我们得出运用λRed重组系统构建的neuC和ompT突变株，在其抗性去除之后相对有抗突变株致病性增强。本研究对突变株抗性去除后致病作用改变的分子机制进行探讨。氨基酸序列比对及编码框预测结果表明，neuC和omp T录本中，除残余的neuC和ompT同源臂片段编码的氨基酸与目标基因的氨基酸100％同源外，未发现抗性去除后引入的外源片段与已知基因间有同源性，且残留的neuC和ompT同源臂片段与抗性去除后引入的外源片段的部分序列之间可以形成有意义的编码框。　　根据预测分析结果，首先，我们对neuC转录本进行了蛋白表达。SDS-PAGE结果显示，表达出了符合预测结果大小的蛋白。其次，我们对无抗突变株中的neuC转录本进行了上中下分段突变，通过SPF鸡感染模型评价分段突变株与无抗突变株E058△neuC间致病性的关系。结果表明，与无抗突变株E058△neuC相比，neuC上段突变株E058△neuCup∷kan在脾脏和肺脏的定植能力显著降低;中段突变株E058△neuCmiddle∷kan在肺脏的定植能力显著降低;下段突变株E058△neuCdown∷kan在被检测SPF鸡的所有脏器中都没有表现出显著差异。这一结果表明，无抗突变株E058△neuC的致病性与neuC转录本的上段与中段序列有关，与下段序列无关。以上结果提示我们，无抗突变株致病作用的放大或许和原基因残留的同源臂片段有关。　　根据预测分析结果，同时构建了缺失ompT ORF不同大小片段的有抗与无抗突变株，运用SPF鸡感染模型对有抗与无抗突变株的致病力进行了评价。结果表明，缺失掉ompT整个的ORF大小及1/2的ORF大小，有抗突变株的体内定植能力均显著下降，其无抗突变株与有抗突变株相比，在SPF鸡体内的定植能力均没有明显差异。缺失掉ompT1/4的ORF大小，有抗突变株的体内定植能力显著下降，然而，无抗突变株较其有抗突变株相比，定植能力也极显著下降。这些结果表明，ompT无抗突变株中残留的原基因片段的大小是导致无抗突变株之间致病作用放大的原因之一。　　我们的结果表明，无抗突变株中残留的原基因功能域是导致无抗突变株致病性改变的原因之一。