【摘 要】
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目的:比较无转移结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者与肝转移（colorectal liver metastases,CRLM）患者血浆外泌体中miR-99b-5p的表达差异;探究人骨髓间充质干细胞（Human bone marrowmesenchymal stem cells,hBMSC）源性外泌体（Exosome,Exos）中miR-99b-5p在CRC发生发展中的作用并
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目的:比较无转移结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者与肝转移（colorectal liver metastases,CRLM）患者血浆外泌体中miR-99b-5p的表达差异;探究人骨髓间充质干细胞（Human bone marrowmesenchymal stem cells,hBMSC）源性外泌体（Exosome,Exos）中miR-99b-5p在CRC发生发展中的作用并探索其可能的调控机制。方法:（1）采用临床血浆样本进行分离提取血浆外泌体,利用实时荧光定量PCR（Quantitative Rea-ltime-PCR,q PCR）技术,比较血浆外泌体miR-99b-5p在无转移CRC患者、CRLM患者中的表达情况。（2）采用超速离心法分离hBMSC上清外泌体,通过透射式电子显微镜、纳米粒子追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）和蛋白免疫印记（Western blot,WB）技术对其进行鉴定;采用共聚焦显微镜观察CRC细胞系LoVo对hBMSC-Exos的摄取情况;利用外泌体抑制剂GW4869抑制hBMSC外泌体分泌,构建Exo-miR-99b-5p低表达模型;利用miR-99b-5p mimic瞬时转染hBMSC细胞,建立hBMSC-Exos中miR-99b-5p过表达模型。通过CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验观察hBMSC-Exos中miR-99b-5p对CRC细胞系LoVo增殖、迁移、侵袭能力的影响。通过WB检测CRC细胞系LoVo中成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor,FGFR3）、波形蛋白、E-粘钙素、N-粘钙素的表达水平,观察hBMSC-Exos对CRC下游蛋白的调控作用。（3）利用CRC细胞系LoVo构建结直肠癌裸鼠皮下成瘤模型,将裸鼠随机分为PBS对照组,Exo-miR-NC组,Exo-miR-99b-5p组,根据分组每周尾静脉注射PBS或相应的外泌体,4周后处死所有小鼠,测定移植瘤体积和质量,观察Exo-miR-99b-5p对裸鼠体内肿瘤生长的影响。采用全自动生化分析仪检测裸鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐和血尿素氮水平,苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色法观察主要脏器组织（心、脑、肝、肺、脾、肾）切片,以观察Exo-miR-99b-5p对裸鼠重要脏器和功能有无影响。结果:（1）qPCR结果显示,CRLM患者血浆外泌体中miR-99b-5p的表达水平（0.46±0.88）明显低于无转移CRC患者（1.36±2.67）,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）hBMSC-Exos鉴定结果:透射式电子显微镜下囊泡呈圆形或椭圆形的双层膜样结构,NTA提示所提取细胞外囊泡直径约50-150nm之间,WB结果表明囊泡表面蛋白CD63、CD9、TSG101阳性,符合外泌体特征;共聚焦显微镜显示CRC细胞LoVo可摄取hBMSC-Exos;外泌体抑制剂GW4869可明显抑制hBMSC外泌体及Exo-miR-99b-5p的产生,LoVo+Exo-miR-99b-5p抑制组较对照组增殖、迁移能力增强。LoVo+Exo-miR-99b-5p过表达组与较对照组增殖、迁移、侵袭能力减弱,WB分析结果显示LoVo+Exo-miR-99b-5p组较NC组细胞E-粘钙素水平升高,FGFR3、N-粘钙素、波形蛋白水平降低。（3）在用LoVo构建的结直肠癌裸鼠皮下成瘤模型中,尾静脉注射Exo-miR-99b-5p组较尾静脉注射PBS对照组及Exo-miR-NC组,肿瘤体积和重量显著减少;三组裸鼠肝肾功能等血清学指标无明显异常,主要器官组织的HE染色未见明显的组织病理学异常或损伤。结论:miR-99b-5p在CRLM中较无转移CRC患者血浆外泌体中表达下调;hBMSC分泌的外泌体中miR-99b-5p可以抑制结直肠癌的进展和转移,这种生物学作用有部分是通过调控FGFR3来影响结直肠癌上皮间充质转化完成的。
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