蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)作为一个所有生命体中主要的调节机制受到越来越多广泛的关注和研究。多样化的蛋白质翻译后修饰显著的增加了蛋白质的结构和功能。现在知道的蛋白质翻译后修饰大约有300种。蛋白的翻译后修饰启动和控制了很多生物学过程,研究PTMS对于研究和了解细胞调控机制是非常重要的。GCN2(general control nonderepressible 2)是真核生物中一种非常重要的调控因子,也叫作 eIF2αK4(eukaryotic initiation factor 2αkinase 4),是一种结构和功能上都高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。GCN2在氨基酸缺失和一些其他的压力诱导下会激活,通过磷酸化EIF2α的Ser52(在酵母和哺乳动物中)发挥作用,调控细胞压力应激反应。到目前为止,GCN2蛋白质表达调控机制鲜为人知。在前期工作中,首次解析了 GCN2的蛋白质泛素化降解机制,发现NEDD4L是GCN2特异性E3连接酶,但有趣的是,NEDD4L识别GCN2并泛素化降解GCN2的作用并不强,NEDD4L需要β-arrestins作为scaffold蛋白将NEDD4L与GCN2拉近,才能发挥泛素化降解作用。因此,为什么NEDD4L自身对GCN2泛素化降解作用较弱是需要进一步探索的科学问题。在哺乳动物去乙酰化Sirtuin家族中,有7个成员,分别为SIRT1-7,其中SIRT1被研究的最为广泛。人类SIRT1蛋白包括747个氨基酸,有一个高度保守的催化结构域。SIRT1蛋白是一个NAD依赖的去乙酰化酶,在哺乳动物稳态维持,衰老,自噬和凋亡的过程中发挥重要的作用。除了对于组蛋白的作用以外,SIRT1也被发现可以去乙酰化一些非组蛋白,例如p53,转录因子NF-κB和许多forkhead家族的转录因子,Ku70等等。通过研究发现,GCN2蛋白具有乙酰化修饰形式,去乙酰化酶抑制剂Sirtinol可以增加GCN2的乙酰化水平。进一步研究发现,过表达SIRT1会引起GCN2蛋白水平的降低,而过表达SIRT1去乙酰化酶失活的突变质粒SIRT1H363Y不能使GCN2的蛋白水平降低。使用SIRT1激活剂Resveratrol处理293T细胞,会引起GCN2蛋白水平降低。而使用SIRT1抑制剂Sirtinol处理293T细胞,会引起GCN2蛋白水平增加。同样的结果也在人的非小细胞肺癌细胞A549,人的宫颈癌细胞Hela和人的肝癌细胞HepG2中出现。我们猜测SIRT1的过表达可能会引起GCN2的降解。通过使用蛋白酶降解系统抑制剂MG132发现,MG132可以逆转SIRT1对GCN2蛋白水平的下调,表明SIRT1对GCN2蛋白水平的下调和蛋白酶体降解系统有关。蛋白酶体降解系统在降解的过程中,需要蛋白的泛素化修饰。在加了 Sirtinol处理的情况下,GCN2泛素化明显降低,表明GCN2乙酰化水平可能会影响GCN2泛素化。GCN2乙酰化水平增加会抑制GCN2泛素化降解,从而增加GCN2的蛋白稳定性。此外,在Sirtinol处理的情况下,GCN2下游基因p-EIF2α和CHOP的蛋白水平表达也增加。有趣的是,在NEDD4L干扰的情况下,SIRT1对GCN2的降解作用减弱,表明SIRT1对GCN2的降解作用依赖于NEDD4L。而Sirtinol可以逆转NEDD4L对GCN2的降解并且可以降低NEDD4L的GCN2之间的相互作用。GCN2具有多个结构域,包括激酶活性结构域和其他的不同功能的调控结构域。经过实验发现SIRT1作用于GCN2的PK1结构域上,而PK1结构域上面的第138位赖氨酸位点突变为精氨酸后,对NEDD4L介导的降解具有显著的影响。在138位赖氨酸突变为精氨酸后,NEDD4L介导的降解减少,而SIRT1对PK1的降解也减少。SIRT1负调控GCN2蛋白质表达的现象在多种肿瘤组织中也得到证实,通过TCGA临床肿瘤样本数据库进行分析,发现在肾上腺皮质癌,皮肤黑色素瘤,子宫癌肉瘤,嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中GCN2表达升高,而SIRT1表达均降低,因此SIRT1与GCN2蛋白质表达在肿瘤样本中呈现负相关性。本研究首次发现了细胞中两个重要的蛋白SIRT1和GCN2的相互关系,并初步阐明了 SIRT1对GCN2降的分子机制,为探索GCN2蛋白质修饰机制、研究GCN2在肿瘤中的调控机理提供了新的思路。