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研究背景:鲍曼不动杆菌是引起各种医院获得性感染,如呼吸机相关性肺炎、中心静脉导管相关性血流感染、尿路感染、手术部位感染和其他类型伤口感染的重要机会性病原体,其中重症监护病房的免疫功能低下患者极易成为其易感人群。在过去十年中,鲍曼不动杆菌的碳青霉烯类抗性是全球范围内的一个新兴问题。鲍曼不动杆菌的碳青霉烯类抗性主要与D类苯唑西林酶(oxacillinases,OXAs)和B类金属β内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)的产生有关,它们是引起鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药的重要机制之一,前者包括bla OXA-51-like、bla OXA-23-like、bla OXA-24-like和bla OXA-58-like基因,后者包括VIM、IMP、SIM、GIM和NDM-1等基因型。许多研究已经证明了插入序列ISaba1在增强bla OXA-23-like和bla OXA-51-like基因表达方面的作用,它促进了菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的发生。基于此,本研究对82株源自ICU的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant A.baumannii,CRAB)分离株进行了碳青霉烯酶基因型的检测。在此基础上,还对CRAB菌株进行了多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的研究。70%乙醇-1%葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate,CHG)的组合被广泛用于本院的外科洗手环节。而苯扎溴铵(benzalkonium bromide,BB)则广泛用于漱口水,洗手液和滴眼液等的配方中。因此,对它们的敏感性监测十分重要。外排泵qac基因常常与菌株对消毒剂的敏感性降低有关,其中,qac E及其减毒变体qac△E1基因在革兰阴性菌中最为常见。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)目前被广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定,其检测成本低、用时短且数据库庞大,给传统微生物带来了革命性的改变。随着对质谱功能的深入探索,关于它的一些拓展应用目前也逐渐走向临床。许多研究表明应用MALDI-TOF MS可快速对医院感染流行株与无关菌株进行区分,且该技术所展现的简便、快速以及有效的分型能力使其成为院感监控领域中一个应用潜力巨大的流行病学分型工具。研究目的:1.了解我院各临床科室ICU来源的CRAB分离株携带的碳青霉烯酶基因类型以及移动遗传元件的携带情况。2.了解我院CRAB分离株流行克隆的分布情况及不同克隆群体间的亲缘关系。3.了解ICU来源的CRAB分离株对本院常用消毒剂的敏感性情况及消毒剂抗性基因的携带情况,分析qac基因阳性菌株与其对消毒剂的敏感性变化之间的关系。4.评价MALDI-TOF MS对短期医院感染CRAB分离株的快速同源性分析的能力,评估其在快速检测医院感染方面的应用价值。研究方法:1.收集2017年3月至2018年2月分离自我院各临床科室ICU的82株对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南和/或美罗培南)耐药(MIC≥8μg/ml)的鲍曼不动杆菌。PCR筛选常见于鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶编码基因(D类:bla OXA-51-like、bla OXA-23-like、bla OXA-24-like、bla OXA-58-like;B类:bla VIM、bla IMP、bla NDM)以及两种移动遗传元件的遗传标记ISaba1和tpn513基因。2.采用MLST分型和e BURST分析对82株CRAB的流行克隆分布以及亲缘关系远近进行分析。3.PCR检测消毒剂耐药基因qac A/B、qac C/D、qac E、qac△E1和qac G;同时,以全敏感鲍曼不动杆菌作为对照,采用96孔板微量肉汤稀释法检测CRAB分离株对本院三种常用消毒剂含氯消毒剂、BB、CHG的MIC值;最后,通过统计学比较,分析qac基因对消毒剂MIC值分布(主要表现为对消毒剂的敏感性降低,即MIC值升高)的影响。4.采用MALDI-TOF MS对CRAB流行株进行同源性分析,以MLST分型结果作为金标准,探讨MALDI-TOF MS在短期医院感染过程中对病原菌进行同源性分析的能力。研究结果:1.82株CRAB分离株中,32株(39.02%)来自于重症医学科,24株(29.26%)来自于呼吸内科ICU,13株(15.85%)来自于神经内科ICU,10株(12.19%)来自于神经外科ICU,3株(3.65%)来自于心血管外科ICU;标本主要来源于痰标本(68株,82.92%),其次为尿标本(8株,9.75%)。2.所有CRAB分离株均检出bla OXA-51-like(82/82,100%)和bla OXA-23-like(82/82,100%)基因,且没有菌株携带bla OXA-24-like、bla OXA-58-like基因以及MBLs基因;只有一株菌未检测到ISaba1基因(81/82,98.78%),且我们的分离株中均未检测到tpn513基因。3.MLST分型结果显示,82株CRAB被分为8个ST型,暂未发现新的ST型。其中,ST540(30,36.58%)检出率最高,它在各个科室ICU中均有检出;其次为ST195(18,21.95%)、ST208(15,18.29%)、ST191(11,13.41%)、ST369(4,4.87%)、ST469(2,2.43%)、ST381(1,1.21%)和ST136(1,1.21%)。以上8个ST型的七个管家基因中仅gyr B或gpi基因发生突变,具有较近的亲缘关系。e BURST分析结果显示,本研究中的8个ST型均属于CC92,它是全世界流行范围最广的一个克隆谱系。4.PCR检测发现,82株CRAB分离株中,63株(76.82%)qac△E1基因阳性,25株(30.48%)qac E基因阳性,未检测到qac A/B、qac C/D以及qac G基因。5.全敏感鲍曼不动杆菌对含氯消毒剂、BB和CHG的MIC值分别为250 mg/L、32μg/m L、0.0019%。82株CRAB对含氯消毒剂的MIC值同敏感株一样,均为250 mg/L,对BB的MIC值变化范围是32-128μg/m L,对CHG的MIC值变化范围是0.0019-0.0078%。经过Kruskal-Wallis检验发现,qac△E1基因阳性与阴性菌株对BB和CHG消毒剂的MIC值分布无显著差异(P>0.05),而qac E基因阳性与阴性分离株对BB和CHG消毒剂的MIC值分布存在显著差异(P<0.05),即qac E基因阳性菌株对BB和CLX消毒剂的敏感性更低。研究结论:1.我院CRAB分离株对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制是产碳青霉烯酶,其中以产D类碳青霉烯酶bla OXA-51-like和bla OXA-23-like为主。其中插入序列ISaba1的高阳性率提示其在促进碳青霉烯类抗生素耐药过程中的重要作用。2.我院ICU中存在着全球优势克隆谱系CC92的广泛流行,该克隆复合体易于获得多重耐药性而在医院环境中广泛传播,全球各个地区均报道过该克隆复合体引起的医院感染流行。3.我院CRAB分离株中普遍存在着消毒剂耐药基因qac E和qac△E1基因的流行,其中,qac E基因阳性菌株会对季铵盐类化合物和双胍类消毒剂的敏感性降低。基于此,我们在进行ICU的消毒清洁工作时要注意消毒剂种类的选择或相应地提高消毒剂的使用浓度,以达到更好的清洁效果。4.MALDI-TOF MS可对短期医院感染流行菌株进行初步的同源性分析,它操作简便、快速、应用前景大,但目前仍缺乏判定标准,需要更多的研究来支持这方面的应用。5.考虑到CRAB感染的难治性和其较强的传播性,我们认为对ICU来源的CRAB分离株进行相关的流行病学分析和消毒剂敏感性检测是至关重要的,它有助于我们及时调整相应的医院感染控制方案,更好的完成本院的预防和感控工作。