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化疗（Chemotherapy）是各期乳腺癌治疗的积极措施,也是引起乳腺癌治疗中骨丢失的重要原因,但其作用机制尚不明确;而且,肥胖也是乳腺癌的发病机率倍增的一大原因,肥胖和肥胖乳腺癌患者体内1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate,S1P）含量显著增加,而S1P信号轴在癌细胞增殖、迁移、形成前转移灶以及骨稳态失衡等方面发挥重要的作用,但化疗药物治疗肥胖型乳腺癌患者所引起的骨骼并发症却鲜有报道。本课题旨在探究化疗药物阿霉素盐酸盐（Doxorubicinhydrochloride,DOX）治疗肥胖型原位乳腺癌小鼠的过程中骨质的变化及S1P信号轴在其中的可能性机制,从而为化疗药物治疗肥胖乳腺癌患者引起的骨质疾病的诊疗提供新的干预靶点。部分一:阿霉素盐酸盐（DOX）治疗肥胖型原位乳腺癌小鼠加剧骨丢失目的:本部分探究阿霉素盐酸盐（DOX）治疗肥胖型原位乳腺癌小鼠的过程中骨质的变化。方法:6周的Balb/c雌性小鼠高脂饮食1月后,原位接种小鼠乳腺癌4T1细胞。7-10天肿瘤长至手可触及时,DOX按5mg/kg剂量经腹腔治疗小鼠,连续3周,每周一次,每周测量小鼠体重及肿瘤大小。实验小鼠分为四组:高脂饮食组予对照溶液PBS组（HFD+PBS）,高脂饮食接种4T1细胞组（HFD+4T1）,高脂饮食予阿霉素盐酸盐组（HFD+DOX）,高脂饮食荷瘤小鼠予阿霉素盐酸盐组（HFD+4T1+DOX）。3周后,小鼠实施安乐死,取出小鼠脾脏、股骨和胫骨。脾脏拍照并称重,随后脾脏和胫骨骨髓制成单细胞悬液,使用流式细胞仪对骨髓来源抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs,CD11b+Gr-1+）的阳性细胞比例进行检测。股骨行 micro-CT扫描后行脱钙、切片、H＆E染色和TRAP染色,检测骨质的变化。结果:1)饲喂小鼠一个月后,与正常饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠体重增加显著。小鼠原位注射乳腺癌4T1细胞,DOX治疗三周后,与HFD+PBS组相比,HFD+4T1+DOX组、HFD+DOX组、HFD+4T1组体重均有不同程度的减轻,但荷瘤小鼠组的脾脏远大于非荷瘤小鼠组;HFD+4T1+DOX组肿瘤大小及质量小于HFD+4T1组。2)流式分析结果表明,相对于另外三组,HFD+4T1+DOX组CD11b+Gr-1+的细胞比例显著升高。3)micro-CT分析显示,与另外三组相比,HFD+4T1+DOX组的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）参数方面均显著降低,而骨面积与骨体积比值（BS/BV）和骨小梁分离度（Tb.Sp）参数显著升高,在力学实验中骨韧度也显著减低。4)小鼠股骨H＆E和TRAP染色结果显示,与HFD+PBS组小鼠相比,其他三组均诱导了小鼠骨小梁的减少,增加了破骨细胞的阳性染色,其中HFD+4T1+DOX组更为严重。结论:高脂饮食造成小鼠肥胖;DOX治疗肥胖型乳腺癌小鼠加剧了小鼠骨质丢失,与破骨细胞活化增加有关。部分二:DOX诱导肥胖型乳腺癌小鼠骨质丢失的相关机制研究目的:将棕榈酸（Palmitic acid,PA）与乳腺癌细胞共育,体外实验探究DOX诱导肥胖型荷瘤小鼠骨质丢失的可能机制。方法:1)通过CCK8方法检测不同浓度的PA或DOX对4T1细胞生长的影响。2)PA和DOX处理4T1细胞三天,RT-qPCR检测SPHK激酶mRNA的表达。3)SPHK激酶抑制剂SKI Ⅱ处理或不处理4T1细胞6h后,PA和DOX处理4T1细胞两天,胰酶消化并用无菌PBS洗涤细胞,然后,细胞培养24h后收集的上清液分别是4T1组、4T1+DOX 组、4T1+PA 组、4T1+PA+DOX 组、4T1+SKI Ⅱ 组、4T1+DOX+SKI Ⅱ 组、4T1+PA+SKI Ⅱ组、4T1+PA+DOX+SKI Ⅱ组,随后开展以下实验:a)条件培养基（上清液:基础培养基=1:9）通过TRAP染色,ALP染色、茜素红染色、RT-qPCR检测相关mRNA的表达,比较不同上清液对小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）破骨分化的影响和对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。b)条件培养基处理BMMs 1h、12h和24h后流式细胞仪检测4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组、4T1+PA+DOX的CD11b+S1PR1+和 CD11b+S1PR1-的细胞比例。c)条件培养基处理 BMMs 1h,RT-qPCR检测相关mRNA的表达。d)条件培养基处理BMMs,Transwell实验观察不同上清液对BMMs迁移的影响。结果:1)CCK8结果表明PA浓度为20uM和DOX浓度为50nM时,4T1细胞的增殖受到一定的抑制作用,在一定程度上模拟了动物实验。2)4T1细胞经PA和DOX联合处理之后,细胞的SPHK1和SPHK2的基因表达显著增加。3)实验结果表明,a)与对照组相比,4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组和4T1+PA+DOX组均能够促进破骨细胞形成（TRAP染色）和抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化（ALP染色、茜素红染色）,并且4T1+PA+DOX组能够形成更大和更多的破骨细胞,RT-qPCR结果显示,与其他各组相比,4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组和4T1+PA+DOX组均能显著促进小鼠破骨相关组织蛋白酶K（CathepsinK,CTSK）,活化T细胞核因子c1（Nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc-1）和树突状细胞-特异性跨膜蛋白（dendritic cells-specific transmembrane protein,DC-STAMP）的 mRNA 的表达,4T1+PA+DOX组效果更为显著,而降低了 MC3T3-E1的骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）,1-型胶原蛋白（Collagen 1,COL-1）和骨钙素（Osteocalcin,OCN）mRNA 的表达。使用 SKI Ⅱ 抑制剂阻断后,4T1+SKI Ⅱ 组、4T1+DOX+SKI Ⅱ 组、4T1+PA+SKI Ⅱ 组、4T1+PA+DOX+SKI Ⅱ组显著减少了破骨细胞的形成和恢复了成骨的ALP染色,并且小鼠破骨相关CTSK、NFATc-1和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）的mRNA表达有所降低,而成骨相关OPN,COL-1和成骨相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）mRNA 的表达有所升高。b)流式结果显示,与对照组相比,4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组和4T1+PA+DOX组处理BMMs 12h和24h后,CD11b+S1PR1+的细胞比例减少,而上清液组处理1h的CD11b+S1PR1+细胞比例无明显变化,而CD11b+S 1PR1-的细胞比例在24h时显著增多。c)RT-qPCR结果显示,与对照组相比,4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组和4T1+PA+DOX 组增加了 1-磷酸鞘氨醇受体 1（Sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1PR1）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的 mRNA 的表达,而降低了 1-磷酸鞘氨醇受体2（S1PR2）、1-磷酸鞘氨醇受体4（S1PR4）、趋化因子受体4（chemokine Receptor Type 4,CXCR4）和基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase,MMP-2）mRNA的表达。d)迁移实验结果显示,4T1组、4T1+DOX组、4T1+PA组和4T1+PA+DOX组增加了破骨前体细胞迁移到小室下表面的细胞数,并且4T1+PA+DOX组迁移到小室下表面的细胞数最多,而使用SKI Ⅱ抑制剂阻断后,4T1+SKI Ⅱ 组、4T1+DOX+SKI Ⅱ 组、4T1+PA+SKI Ⅱ 组、4T1+PA+DOX+SKI Ⅱ 组迁移到下室的细胞数显著减少。。结论:PA联合DOX处理4T1细胞后的上清液可通过SPHK-S1P-S1PR的信号增加破骨前体细胞的迁移和促进破骨细胞的成熟,同时抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。本部分实验结果表明,上述两者协同作用可能是DOX治疗肥胖型乳腺癌小鼠导致严重骨丢失的原因。