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D-型氨基酸作为医药及食品领域的重要原材料,被广泛用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂、甜味剂等生产.一般均采用生物酶转化法生产D-氨基酸.D-型氨基酸及其衍生物的生物转化,经历两个反应历程,首先是在海因酶的作用下,催化5-单取代海因形成氨甲酰类氨基酸中间物,后者再在酶或化学的转化下,生成相应的光学活性氨基酸或其衍生物.因此,D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的重要催化剂,成为手性产物研究领域的热点.1.假单胞杆菌YZ-Ⅱ 6发酵条件的研究;该研究室自行分离到一株具有较高D-海因酶活性的菌株假单胞杆菌(Pseudomonas putida YZ-Ⅱ6),对此菌产酶的最适条件进行了研究,结果表明,该菌产海因酶最佳发酵条件为起始pH值7.0的YCG培养基,并用0.1％海因诱导,26℃摇床培养约20h,酶活力可达到1.3U/mL菌液(OD<,600>=10).2.工程菌pET-hdase/E.coli BL21稳定性和培养条件的初步研究;从菌株YZ-Ⅱ 6中克隆得到海因酶基因,并构建重组质粒pET-hdase,在E.coliBL21中得到高效表达.对工程菌pET-hdase/E.coli BL21的产酶过程中诱导剂,温度,培养时间以及质粒的稳定性进行了研究,在不加诱导剂的LB培养基中,30℃摇床培养12-14h时,其海因酶活力可达到13U/mL菌液(0D<,600>=10),约为原始菌株的10倍.3.固定化工程菌pET-hdase/E.coli BL21;用海藻酸钙的方法对工程菌pET-hdase/E.coli BL21进行固定,其中海因酶的活性回收随着细胞量的增加而下降.在50℃,0.05mol/LTris-盐酸,pH9.0缓冲液的最适酶反应条件下,以海因为底物时,酶活力可达到40U/(g)beads,以D-对羟基苯海因为底物时,酶活力比非固定菌体细胞提高2倍,达6.8U/(g)beads.固定化细胞经重复使用5次后活力没有下降,颗粒也没有溶破,在蒸馏水保存的半衰期为14天,添加100μL/mL的氨苄青霉素防止杂菌污染.4.生物酶法生产N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸;用化学方法制备海因酶底物对羟基苯海因,再用固定化工程菌pET-hdase/E.coli BL21转化N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸,经HPLC分析,上清液里有大量的产物存在,由于浓缩过程中提高了盐浓度,给后处理带来了一定困难,需要进一步改进.