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酸橙(Citrus aurantium L.)是枳实、枳壳的基源植物,目前评价酸橙资源优劣的指标主要是其幼果中辛弗林(Synephrine)、新橙皮苷(Neohesperidin)和柚皮苷(Narigin)三种物质的含量。但是由于上述物质既非酸橙的特有,也非酸橙含量最高的次生代谢产物。此外,由于酸橙本身外观性状变异度高,民间同种异名现象严重,导致酸橙虽然具有独特的药用价值,但酸橙资源的利用受到极大制约。多甲氧基黄酮(Polymethoxylflavones,PMFs)是酸橙中一类次生代谢产物,研究表明,不同柑橘材料中PMFs的种类、含量具有特异性,但目前对于酸橙PMFs的成分、含量研究尚不全面,使PMFs难以用于酸橙资源的系统评价。肠道是重要的消化和免疫器官,对电离辐照敏感。当发生核泄露事故或肿瘤患者接受盆腔放射治疗时,电离辐射可能引发放射性肠损伤,患者表现出电解质紊乱,吸收功能丧失甚至死亡。目前,尚无针对放射性肠损伤的特效药。PMFs具有抗氧化、抗炎等多种生物活性,同时枳实或枳壳在防治消化系统疾病方面也有广泛的应用,但酸橙PMFs对放射性肠损伤的作用尚没有研究报道。因此,本研究首先以12个不同品种的酸橙果实为材料,检测了酸橙果皮中PMFs的组成和含量,并分析了PMFs在不同酸橙品种中的特征,为利用PMFs评价酸橙资源提供信息。其次,筛选并探讨了不同大孔吸附树脂对酸橙主要类黄酮单体的吸附特性,并利用HPD750富集制备了酸橙PMFs混合物,用于后续的活性验证;然后,利用网络药理学预测了酸橙PMFs混合物缓解小鼠放射性肠损伤的潜在靶点;最后,利用动物局部辐照致放射性肠病模型、细胞毒性实验,初步验证了酸橙PMFs对放射性肠损伤的防护作用。本研究的主要结果如下:(1)不同酸橙品种果实中PMFs提取与成分特征分析为分析检验不同酸橙品种PMFs的成分、含量特征,以12个酸橙品种为材料,采用乙醇热提取法和高效液相色谱法,提取并检测了12个酸橙品种中主要类黄酮的成分及含量。其中,不同酸橙品种的类黄酮总含量在955~4,327.5μg/g DW范围内,类黄酮总含量最低的品种为鲁比杜克斯酸橙,类黄酮总含量最高的品种为枸头橙。不同品种的酸橙样本中,多甲氧基黄酮含量在32(摩洛哥酸橙)~48(联合酸橙)μg/g DW之间。酸橙的多甲氧基黄酮单体主要为川陈皮素、七甲氧基黄酮、5,7,4‘-三甲氧基黄酮、甜橙黄酮和异橙黄酮。聚类分析结果表明,不同品种酸橙多甲氧基黄酮成分、含量相似,可显著区分于大红袍红橘、纽荷尔脐橙和梁平柚。在酸橙内部,12个品种多甲氧基黄酮特征可分为三个主要分支。酸橙中柚皮苷、新橙皮苷含量与多甲氧基黄酮总量无显著相关性,但柚皮苷与5,7,3‘,4‘-四甲氧基黄酮含量呈显著相关。上述结果表明,酸橙PMFs组成、含量具有一定品种间特异性,同时也具有一定种间差异性,可以作为评价和区分酸橙种质资源的检测指标。(2)酸橙多甲氧基黄酮混合物分段富集为得到酸橙PMFs用于防治放射性肠病功效验证,建立了高效液相色谱(HPLC)测定柑橘主要类黄酮的方法,利用静态吸附实验探讨不同大孔吸附树脂对酸橙主要类黄酮单体的吸附特性,并富集制备了酸橙PMFs混合物。结果表明,建立的HPLC检测酸橙类黄酮方法准确可靠,适用性良好,可用于9种柑橘类黄酮的定性定量检测;溶解度实验表明,四种类黄酮物质(柚皮素、橙皮素、川陈皮素、橘皮素)在无水乙醇中溶解度顺序分别为柚皮素>川陈皮素>橙皮素>橘皮素,有望通过调节乙醇体积分数实现橘皮素与其他化合物的分离。通过静态吸附实验筛选出了对4种类黄酮化合物具有吸附特异性的6种大孔树脂和1种普适性的大孔树脂,并通过吸附热力学实验发现:(1)在所选的7种大孔吸附树脂中,ADS-7、HPD 300和CAD 40型大孔树脂吸附柚皮素为吸热过程,HPD 750、HPD 400、NKA-9和DA 201型大孔树脂吸附柚皮素为放热过程;而橙皮素、川陈皮素和橘皮素在7种大孔树脂上的吸附均为放热过程,提高橙皮素、川陈皮素、橘皮素的吸附浓度和降温有利于吸附反应发生。(2)柚皮素和橙皮素在HPD 300和HPD 400型树脂上的吸附模式更符合Freundlich模型,为多层物理吸附;在其余5种树脂上的吸附则符合Langmuir模式。7种大孔树脂吸附川陈皮素符Freundlich热力学模型,而吸附橘皮素的过程更符合Langmuir模型;利用大孔吸附树脂HPD750对酸类黄酮粗提物中不同成分的吸附差异,对多甲氧基黄酮和黄烷酮进行了分离,富集得到了相对含量67.44%的多甲氧基黄酮混合物,可用于后续的生物活性研究。与粗提物相比,富集产物主要成分未发生改变,但橘皮素的相对含量显著提高,甜橙黄酮、七甲氧基黄酮相对含量未见显著提高。(3)酸橙PMFs缓解放射性肠损伤潜在靶点网络药理学分析为预测酸橙PMFs缓解放射性肠损伤的可能作用机理,运用网络药理学研究方法,从公开发表转录组数据中挖掘放射性肠损伤的差异表达基因并利用数据库检索川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮及异橙黄酮的潜在靶点,并通过拓扑学分析获得酸橙PMFs缓解放射性肠损伤的潜在核心靶点。功能富集分析表明,辐照后参与小鼠肠道细胞黏附、细胞分泌因子、氨基酸代谢、凝血功能等途径的基因表达显著下调;参与细胞周期、突触形成等途径的基因表达显著上调。KEGG通路富集结果表明,辐照显著影响PI3K-Akt、p53、糖代谢等相关通路。酸橙多甲氧基黄酮混合物可能通过生物节律、癌症表达相关途径和NOD样受体信号途径三个生物子网络调控肠道上皮稳态,维持肠道功能。将子网络中相关靶点进行蛋白质互作(Protein-Protein interaction,PPI)网络拓扑学分析,以度(Degree)、中介中心性(Betweeness centerility)、紧密中心性(Closeness centerility)为衡量指标,获得11个核心靶点(Creb1、Mapk1、Mapk14、Met、Mmp9、Mtor、Nos2、Pparg、Ptk2、Rela、Tlr4)。(4)酸橙多甲氧基黄酮对小鼠放射性肠损伤预防作用研究利用60Co源γ射线进行腹部辐照12 Gy构建KM小鼠放射性肠损伤模型,观察酸橙PMFs预处理对放射性肠损伤的预防作用。小鼠肠道损伤严重,体重迅速下降,并在辐照后10-15天死亡。酸橙PMFs分别以50 mg/Kg、200mg/Kg、800 mg/Kg剂量灌胃小鼠,观察酸橙PMFs对放射性肠损伤的预防作用,结果表明200 mg/Kg酸橙多甲氧基黄酮处理可以降低KM小鼠辐照后体重损失,缓解脏器损伤和调节脂肪指数,而50 mg/Kg和800 mg/Kg无缓解放射后体重和脏器指数变化的作用。200 mg/Kg酸橙多甲氧基黄酮处理缓解放射造成的回肠、结肠粘膜损伤,减少炎性细胞浸润,维持回肠隐窝数量,同时减少回肠、结肠粘液层的异常分布,维持辐照后正常小肠隐窝的数量,但对增殖影响不显著。实时定量PCR(RT-q PCR)表明,多甲氧基黄酮可能通过调控Mmp9等的表达维持肠道上皮稳态,促进肠道损伤修复。此外,酸橙多甲氧基黄酮处理可以缓解辐照后小鼠谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CRE)和尿酸(UA)水平升高,并降低小鼠血浆白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平。体外细胞毒性研究表明,酸橙PMFs对人正常肠上皮细胞系CCD 841 Co N的IC50值为42.23μg/m L,川陈皮素对CCD 841 Co N细胞IC50值为51.58μg/m L,橘皮素和甜橙黄酮在最大溶解度范围内对细胞活力的抑制率均不超过50%。此外,酸橙多甲氧基黄酮还可缓解硫酸葡聚糖钠盐(Dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠结肠炎,减慢疾病进展指数(Disease active index,DAI)升高,缓解结肠水肿和变短,维持肝脏形态,同时降低血浆中炎症因子IL-1β、IL-6的水平,减少血浆中AST、ALT水平升高。上述结果表明,酸橙PMFs可以缓解放射损伤造成的肠道上皮屏障功能障碍,降低炎症水平,同时预防因菌群移位感染造成的肝、肾损伤,该过程可能通过调控Mmp9表达实现。