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许多研究表明,癌症、病毒入侵等的发生都伴随着肠道屏障的损伤。苦瓜籽蛋白MAP30是从苦瓜籽中分离得到的一种核糖体失活蛋白,具有显著的抗病毒和抗癌活性。目前对MAP30的研究大多集中在抗癌抗病毒活性评价方面,而对癌症患者及病毒感染者的肠道屏障损伤方面的研究还未见报道。本文从苦瓜籽中分离得到高纯度MAP30蛋白,证明其具有显著的抗癌活性,在此基础上,从肠道紧密连接的角度探究MAP30对肠道屏障损伤的改善机制,并研究了MAP30中主要必需氨基酸色氨酸对肠道屏障紧密连接的保护和修复作用。本文的主要研究结果如下:1.苦瓜籽MAP30的提取纯化与性质表征对苦瓜籽中的主要成分进行分析,发现苦瓜籽中氨基酸种类丰富,含有全部8种必需氨基酸和丰富的Ca、Mg、K等金属元素;苦瓜籽中共检出7种主要脂肪酸,不饱和脂肪酸含量为64.34%;苦瓜籽中粗蛋白含量为31.07%,其中主要为盐溶蛋白和水溶蛋白,有利于下一步提取盐溶性蛋白MAP30。采用盐提,硫酸铵分级,透析,凝胶柱层析分离的方法提取纯化苦瓜籽中的MAP30蛋白,得到的样品经SDS-PAGE电泳呈单一稳定条带,分子量约为30 k Da,经Nano LC-MS/MS鉴定所得样品即为MAP30。氨基酸组成分析表明,MAP30中必需氨基酸色氨酸和亮氨酸含量最高,均为8.12%。MTT实验表明MAP30对小鼠黑色素瘤B16细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肝癌Hep G2细胞均具有增殖抑制作用。2.MAP30对肠道紧密连接损伤的改善及其机制将MAP30作用于脂多糖（LPS）损伤的Caco-2细胞单层紧密连接模型,与未损伤组相比,LPS导致细胞单层跨膜电阻值（TEER）降低30%,荧光黄通过量（LY-Flux）升高36%;0-40μg/m L MAP30对LPS介导的TEER和LY-Flux的改变均有不同程度的改善效果,且效果呈现剂量效应,中、高浓度（20μg/m L、40μg/m L）MAP30作用组TEER与LY-Flux均恢复到未损伤组同一水平,说明MAP30能有效改善LPS诱导的肠道屏障紧密连接完整性和通透性改变。蛋白和基因表达水平上,经100μg/m L LPS作用24 h后,单层细胞主要紧密连接蛋白Claudin-1,Occludin和ZO-1的蛋白表达量分别下调39%、28%和29%,m RNA表达量分别下调66%、25%和61%;不同浓度MAP30均能有效改善LPS引起的Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白和m RNA表达量下调,且对Claudin-1的调控作用最为显著,与未损伤组相比,高浓度MAP30组Claudin-1蛋白表达量上调了79%,m RNA表达量上调了55%。核转录因子（NFκB）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）是导致肠道紧密连接（TJ）通透性增加,屏障功能受损的重要炎症因子。而细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和丝裂原活化蛋白（MAP）信号通路的激活会调节肠上皮细胞的细胞旁通路转运,进而增强TJ的屏障功能。本研究发现MAP30能显著提高ERK1/2和MAP的m RNA表达量,显著抑制NFκB和MLCK的表达,说明MAP30可能是通过激活ERK1/2-MAP通路和抑制NFκB-MLCK信号通路来调控相关蛋白基因的表达,实现对肠道紧密连接损伤的保护。3.色氨酸对肠道屏障紧密连接的保护和修复作用选取MAP30中的必需氨基酸色氨酸作用于单层模型,从保护和修复两方面探究色氨酸对肠道紧密连接的影响,发现8μg/m L和16μg/m L色氨酸能有效缓解LPS导致的TEER值的降低,其中8μg/m L色氨酸修复组的TEER值达到未损伤组的98.6%,8μg/m L色氨酸保护组的TEER值高出未损伤组12%;4μg/m L和8μg/m L色氨酸能显著降低LPS导致的LY-Flux的升高,色氨酸保护组和修复组LY-Flux均恢复到与未损伤组同一水平。说明色氨酸可有效保护和修复肠道紧密连接的完整性和通透性,且保护作用效果强于修复作用。蛋白表达水平上,与未损伤对照组相比,LPS损伤组Claudin-1、Occludin和ZO-1表达量分别下调38%、26%和29%,中浓度（8μg/m L）和高浓度（16μg/m L）色氨酸保护组Claudin-1的蛋白表达量显著回升,分别达到未损伤组的93%和114%,Occludin和ZO-1表达量回升不显著;色氨酸修复组Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达量变化不显著。m RNA测定结果与蛋白基本一致,不同浓度色氨酸均能显著缓解Claudin-1的m RNA表达量下调,中浓度组达到未损伤组的78%,高浓度组高出未损伤组45%;色氨酸对Occludin和ZO-1 m RNA表达量的影响不显著。在信号通路方面,色氨酸也可能是通过激活ERK1/2-MAP通路和抑制NFκB-MLCK信号通路实现对肠道紧密连接损伤的改善。但在肠道屏障紧密连接完整性和通透性,紧密连接相关基因蛋白以及信号因子表达的调控等方面,MAP30的作用效果均优于色氨酸,猜测MAP30对肠道屏障TJ的调控中,可能还有其他氨基酸或活性结构的协同作用。