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甘遂为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属植物甘遂(Euphorbiakansui T.N.Liou ex T.P.Wang)的干燥块根,主产于陕西、山西、河南等地,是常用的有毒中药材之一。始载于《神农本草经》,列为下品,具有泻水逐饮之功。其有毒成分主要是二萜类化合物,现代临床上多用于治疗肝硬化腹水、胸腔积液、水肿、咳喘、肿瘤等病症。但甘遂生品具有强烈的刺激性和毒性,尤其是胃肠道的毒性。生品仅限外用,内服必经炮制,以保证临床应用的安全性。利用硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱分离手段,从甘遂的毒效部位乙酸乙酯萃取物中共分离得到了 12个化合物,通过化学方法和核磁共振数据分析,鉴定了 9个,其中假白榄烷型二萜类1个,甘遂萜脂B[kansuininB](EK-01)。巨大戟烷型二萜类2个:3-0-(2,3—二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-巨大戟二萜醇,[3-6O-(2,3-dimethylbutanoy1)-13-O-dodecanoy1-ingeno1](EK-02)。5-O-苯甲酰-20-去氧巨大戟二萜醇,[5-benzoy1-20-deoxyingenol](EK-03)。三萜类化合物1个大戟醇[euphol](EK-04),其他化合物异东莨菪素[Isoscopletin](EK-05),腺苷[Adenosine](EK-06),羟基酪醇[hydroxytyrosol](EK-07),2’,4’,7-三径基异黄酮[2,4,7-3 hydroxy isoflavones](EK-08),大黄素[Emodin](EK-09)。其中 EK-6 腺苷,EK-7羟基酪醇腺苷,EK-8 2’,4V,7-三羟基异黄酮,为首次从该植物中分离得到的化合物。采用MTT法评价了甘遂中分离得到的部分单体化合物对大鼠肠上皮细胞IEC-6的毒性,结果表明,巨大戟烷型二萜类成分EK-03的细胞毒性大。假白榄烷型二萜类化合物EK-01(Kansuinine B)和三萜类化合物EK-04(大戟醇)未显示出较好的细胞毒性作用,EK-09(大黄素)对肠上皮细胞ICE-6具有较好的抑制作用。为研究甘遂二萜类成分对胃肠道的毒性,研究了二萜类成分EK-03对大鼠肠上皮细胞IEC-6的毒性及作用机制:1、采用MTT法检测细胞抑制率,实验结果显示EK-03对大鼠肠上皮细胞IEC-6细胞具有显著的细胞毒性(P<0.01),且呈一定的剂量相关性2、采用流式细胞术和HCS等方法检测细胞周期和凋亡率;结果显示EK-03能够诱导大鼠肠上皮细胞IEC-6凋亡(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;3、采用HCS检测细胞凋亡通路、Real-time PCR和Western-blot方法检测细胞中凋亡基因的mRNA表达和蛋白的表达。结果表明EK-03能够显著降低IEC-6细胞核Hoechst荧光强度、线粒体膜电位荧光强度、细胞色素C荧光强度(P<0.05),且呈一定的剂量相关性;能够显著增加细胞膜通透性荧光强度(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;Real-timePCR结果显示EK-03能够显著上调大鼠肠上皮细胞IEC-6的caspase-3,8,9mRNA的表达(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;Western-blot分析结果显示EK-03能够显著上调大鼠肠上皮细胞IEC-6 的 cytc-cytosol、β-actin、Bax、AIF、Apaf-1 蛋白的表达(P<0.01),且呈一定的剂量相关性;能够显著下调大鼠肠上皮细胞IEC-6的cytc-mitochondria、Bcl-2蛋白的表达(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。结果表明EK-03通过了线粒体途径表现了肠毒性。