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目的：补阳还五汤(BYHWD)是由生黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁等7味常见中药组成的复方，是清代《医林改错》作者王清任治疗脑卒中(俗称“中风”)的经典名方。现代临床常用BYHWD治疗中风后遗症，即中风后出现的口眼歪斜，对侧肢体感觉障碍甚至偏瘫等症。为了进一步探究BYHWD药效机制，本实验选取了外泌体这一关键细胞间信号传递因子，研究BYHWD是否通过外泌体转导在体内发挥其药效作用，为中医中药治疗缺血性脑卒中(CIS)疾病提供理论依据。
方法：
1.SD大鼠中风模型建立：SD大鼠适应性喂养一周后，采用传统线栓的方法建立大脑中动脉堵塞模型(MOAC)。造模成功后随机将大鼠分为模型组(MCAO)、中药组(BYHWD)，并同时设立空白组(Con)作为对照。使用BYHWD药物提取液按照18g/kg/d灌胃标准对BYHWD组灌胃治疗，其余饲养条件相同。在造模第7天处死各个组大鼠共40只，检测造模成功相关指标，包括：神经功能评分指标(NS)、脑梗死体积(IV%)。
2.补阳还五汤治疗CIS后大鼠脑梗相关指标评价：制备相关病理切片；对脑组织病理切片进行炎症因子NF-κB、TNF-α的免疫组化染色(IHC)，并进行ImageJ图像定量分析；HE染色观察梗死区脑组织病理变化。
3.外泌体对BYHWD治疗CIS效用机制研究：使用透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析仪(NTA)和免疫蛋白印迹(WB,Western Blot)鉴定从大鼠血清中提取出的外泌体；WB检验各组DLL4蛋白表达情况；使用液相串联质谱(MS)分析BYHWD组和MCAO组外泌体差异蛋白表达；定量PCR检测Notch、VEGF通路相关基因HES1、DLL4、VEGF-A和RAP1A表达量变化。
4.体外实验验证外泌体是否来源于内皮细胞：使用BYHWD干粉剂培养内皮细胞，寻找最适药物浓度；WB检验BYHWD组外泌体和Con外泌体中DLL4表达量；
结果：
1.对大鼠神经功能评分和脑组织TTC染色，结果显示：大鼠MCAO造模成功，脑梗死面积均在37%以上，符合造模成功评判标准，神经功能评分差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.炎性因子指标结果显示：BYHWD组大鼠脑组织炎症侵袭程度低于MCAO组和Con组；结果均具有统计学意义(p＜0.05)。
3.TEM、NTA和WB鉴定结果显示，提取出的样品符合外泌体鉴定标准；WB验证各组DLL4蛋白表达结果发现，BYHWD组DLL4蛋白表达明显低于MCAO组和Con组，灰度值差异使用ImageJ软件分析，差异有统计学意义(P＜0.05)；MS分析结果显示，BYHWD外泌体与CIS后血管生成相关通路如Notch、VEGF等有密切联系；使用PCR验证BYHWD外泌体mRNA发现，BYHWD组的DLL4基因表达明显低于Con和MCAO。BYHWD组的HES1基因表达明显低于Con组，与MCAO相比无显着差异，DLL4与HES1基因表达量的变化与Notch通路密切相关，证实了MS分析结果。另外，BYHWD组的VEGF-A基因表达明显高于其他二组，与MCAO相比最为明显。VEGF-A基因的表达在BYHWD组最高，MCAO低于Con。同时，BYHWD组RAP1A基因的表达明显高于Con，低于MCAO组，RAP1A基因表达异常升高与血小板活化、血栓形成等有关。使用SPSS17.0分析数据结果发现，以上数据差异结果有统计学意义(P＜0.05)；
4.体外实验验证结果：BYHWD提取液培养内皮细胞最适药物浓度为0.25mg/ml；WB检验出BYHWD外泌体DLL4含量低于Con组，同体内结果相一致。灰度值使用ImageJ软件进行分析，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
讨论：
BYHWD在临床上应用于中风已达数百年，作用机制研究多为发挥脑保护作用等方面。本实验证明了BYHWD可以影响CIS损伤后血管生成，其中内皮细胞源性外泌体起到了调节介质的作用，可能与外泌体被证明的细胞间信息交换和载药功能相关。然而，BYHWD中起主要作用的药效成分尚未明确，此问题较为突出，是我们的下一步研究重点。
结论：
在MCAO大鼠模型上，BYHWD对CIS脑损伤具有明确的降低炎症水平，缩小脑梗面积作用。其作用机理可能与BYHWD影响内皮细胞源性外泌体介导DLL4/Notch通路发挥损伤后血管生成有关。同时，DLL4与VEGF-A表达上调，可能为Notch通路与VEGF通路协同作用。以上结论为BYHWD治疗CIS提供新的理论指导。
方法：
1.SD大鼠中风模型建立：SD大鼠适应性喂养一周后，采用传统线栓的方法建立大脑中动脉堵塞模型(MOAC)。造模成功后随机将大鼠分为模型组(MCAO)、中药组(BYHWD)，并同时设立空白组(Con)作为对照。使用BYHWD药物提取液按照18g/kg/d灌胃标准对BYHWD组灌胃治疗，其余饲养条件相同。在造模第7天处死各个组大鼠共40只，检测造模成功相关指标，包括：神经功能评分指标(NS)、脑梗死体积(IV%)。
2.补阳还五汤治疗CIS后大鼠脑梗相关指标评价：制备相关病理切片；对脑组织病理切片进行炎症因子NF-κB、TNF-α的免疫组化染色(IHC)，并进行ImageJ图像定量分析；HE染色观察梗死区脑组织病理变化。
3.外泌体对BYHWD治疗CIS效用机制研究：使用透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析仪(NTA)和免疫蛋白印迹(WB,Western Blot)鉴定从大鼠血清中提取出的外泌体；WB检验各组DLL4蛋白表达情况；使用液相串联质谱(MS)分析BYHWD组和MCAO组外泌体差异蛋白表达；定量PCR检测Notch、VEGF通路相关基因HES1、DLL4、VEGF-A和RAP1A表达量变化。
4.体外实验验证外泌体是否来源于内皮细胞：使用BYHWD干粉剂培养内皮细胞，寻找最适药物浓度；WB检验BYHWD组外泌体和Con外泌体中DLL4表达量；
结果：
1.对大鼠神经功能评分和脑组织TTC染色，结果显示：大鼠MCAO造模成功，脑梗死面积均在37%以上，符合造模成功评判标准，神经功能评分差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.炎性因子指标结果显示：BYHWD组大鼠脑组织炎症侵袭程度低于MCAO组和Con组；结果均具有统计学意义(p＜0.05)。
3.TEM、NTA和WB鉴定结果显示，提取出的样品符合外泌体鉴定标准；WB验证各组DLL4蛋白表达结果发现，BYHWD组DLL4蛋白表达明显低于MCAO组和Con组，灰度值差异使用ImageJ软件分析，差异有统计学意义(P＜0.05)；MS分析结果显示，BYHWD外泌体与CIS后血管生成相关通路如Notch、VEGF等有密切联系；使用PCR验证BYHWD外泌体mRNA发现，BYHWD组的DLL4基因表达明显低于Con和MCAO。BYHWD组的HES1基因表达明显低于Con组，与MCAO相比无显着差异，DLL4与HES1基因表达量的变化与Notch通路密切相关，证实了MS分析结果。另外，BYHWD组的VEGF-A基因表达明显高于其他二组，与MCAO相比最为明显。VEGF-A基因的表达在BYHWD组最高，MCAO低于Con。同时，BYHWD组RAP1A基因的表达明显高于Con，低于MCAO组，RAP1A基因表达异常升高与血小板活化、血栓形成等有关。使用SPSS17.0分析数据结果发现，以上数据差异结果有统计学意义(P＜0.05)；
4.体外实验验证结果：BYHWD提取液培养内皮细胞最适药物浓度为0.25mg/ml；WB检验出BYHWD外泌体DLL4含量低于Con组，同体内结果相一致。灰度值使用ImageJ软件进行分析，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
讨论：
BYHWD在临床上应用于中风已达数百年，作用机制研究多为发挥脑保护作用等方面。本实验证明了BYHWD可以影响CIS损伤后血管生成，其中内皮细胞源性外泌体起到了调节介质的作用，可能与外泌体被证明的细胞间信息交换和载药功能相关。然而，BYHWD中起主要作用的药效成分尚未明确，此问题较为突出，是我们的下一步研究重点。
结论：
在MCAO大鼠模型上，BYHWD对CIS脑损伤具有明确的降低炎症水平，缩小脑梗面积作用。其作用机理可能与BYHWD影响内皮细胞源性外泌体介导DLL4/Notch通路发挥损伤后血管生成有关。同时，DLL4与VEGF-A表达上调，可能为Notch通路与VEGF通路协同作用。以上结论为BYHWD治疗CIS提供新的理论指导。