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目的:纳米乳(nanoemulsions,NE)提高难溶性药物口服吸收已是众所周知,然而当药物还存在肠道首过代谢时,由于NE自身在肠道的消化,对药物的肠道代谢不能提供保护。本实验室对此进行了深入研究,构建了非脂解NE(Non-lipolysisnanoemulsions,NNE)对药物肠道代谢进行保护。本文以在肠道发生Ⅱ型肠道首过代谢(Intestinalfirstpassmetabolism,IFPM)的难溶性雷洛昔芬(Raloxifene,RAL)为模型药物,对传统的脂解纳米乳(Lipolysisnanoemulsions,LNE)与NNE避免RAL的IFPM,促进其口服吸收进行系统的体内外研究。
方法:1.RAL-NE处方优化。在RAL-LNE/NNE中含有的亚油酸(Linoleicacid,LOA)和棕榈酸异丙酯(Isopropyopalmitate,IPP)为非脂解油;大豆油(Soybeanoil,SBO)为脂解的油,乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor?RH40,RH40)、无水乙醇为助乳化剂,三者比例为3∶5∶2基础上,以RAL的载药量对处方进行优化,载药量通过RAL在预乳中的溶解度来确定,最后并对制备的NE进行粒径及分布、形态及稳定性进行评价。
2.RAL-LNE与RAL-NNE的体外代谢研究。(1)RAL-LNE、RAL-LNE与RAL-NNE加入在含猪胰脂肪酶(PPL)或不含PPL的体外脂解体系中脂解60min;(2)上述脂解体系加入到加入含UDP-glucuronosyltransferase1A10(UGT1A10)和1A8(UGT1A8)的体外代谢体系中,37℃无氧气浴,温孵120min;HPLC检测RAL及其代谢产物RAL-6-β-葡萄糖醛酸苷(R-M1)和RAL-4’-β-葡萄糖醛酸苷(R-M2)的含量,最后计算和对比不同制剂的RAL代谢率(W代谢,%)及R-M1和R-M2的生成率(W生成,%)。
3.RAL-LNE与RAL-NNE在SD大鼠在体单向肠灌流的吸收机制研究。(1)SD大鼠RAL-LNE在小肠的四种肠段(十二指肠、空肠、回肠与结肠)灌流120min,测定并计算RAL的有效渗透系数(Peff)和吸收速率常数(Ka),比较不同肠段吸收差异;(2)比较RAL-LNE与RAL-NNE吸收的差异;(3)SD大鼠肠道吸收机制研究,通过Ka及Peff比较三种胞饮的抑制剂(阿米洛利、氯丙嗪和制霉菌素)对RAL-NNE吸收的影响,探讨吸收机制。
4.RAL-LNE与RAL-NNE的SD大鼠和五指山小型猪口服吸收研究。(1)健康雌性SD大鼠,分别按45mg·kg-1灌胃给予RALC为2.25mg·mL-1的RAL-NNE、RAL-LNE和RAL-SUSP;以10mg·kg-1静脉注射RAL-SOL(4mg·mL-1RAL)。于规定时间眼眶取血0.4mL、离心分离血浆、HPLC测定RAL含量,计算各组制剂的生物利用度参数。(2)健康雌性五指山小型猪,给药前注射阿托品、舒泰和速眠新(1∶3)麻醉,按10mg·kg-1分别灌胃给予RALC为2.25mg·mL-1的RAL-NNE、RAL-LNE和RAL-SUSP,以1.67mg·kg-1静脉注射RAL-SOL(4mg·mL-1RAL),前腔静脉取5mL,离心分离血浆,HPLC测定RAL含量,计算各组制剂的生物利用度参数。
结果:1.RAL-NE处方优化。以RAL载药量为指标,对NE中各成分比例进行优化,获得了RAL-LNE和RAL-NNE最佳比例:混合油(LOA∶SBO/IPP=2∶1)∶RH40∶无水乙醇=5∶3∶2;在满足成乳性、24h稳定性、粒径(＜100nm)和PDI(＜0.2)的条件下,以辅料总C为0.067g·mL-1,RALC为2.25mg·mL-1的NE进行后续研究。
2.RAL-LNE与RAL-NNE的体外代谢。(1)RAL-SOL在UGT1A8及UGT1A10体外代谢体系中,RAL代谢率分别为57.41±0.86%和99.29±2.83%,R-M1与R-M2的生成率分别为20.61±0.33%,36.71±1.07%;(2)当RAL-LNE加入不含PPL的体外脂解体系中(即不脂解),然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率低(UGT1A8:-0.69±1.87%,UGT1A10:10.03±0.92%),而当RAL-LNE加入含有PPL体外脂解体系中(即脂解),然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率则大幅上升(UGT1A8:46.00±0.83%,UGT1A10:51.83±2.95%);(3)RAL-NNE加入不含PPL体外脂解体系中,然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率很低(UGT1A8:0.50±0.49%,UGT1A10:5.69±1.34%),RAL-NNE加入含有PPL体外脂解体系并进行体外代谢,发现与未脂解RAL-NNE的RAL代谢率变化并不大,UGT1A8及UGT1A10代谢率分别为5.70±1.45%(P＜0.001)和10.84±3.13%(P＜0.001)。体外研究表明,RAL-NNE确实起到了保护RAL不被代谢的作用。与RAL-SOL比较,体外代谢酶为UGT1A8时,经脂解后的RAL-LNE中RAL代谢率显著减少了11.41%(P＜0.001),而RAL-NNE中的RAL代谢率显著减少了51.71%(P＜0.001)。体外代谢酶为UGT1A10时,脂解后的RAL-LNE中的RAL代谢率显著减少了47.46%(P＜0.001),脂解后的RAL-NNE中的RAL代谢率显著减少达到88.45%(P＜0.001)。因此,在同等的体外代谢体系的条件下,UGT1A10对RAL各制剂的药物代谢作用均比UGT1A8更强。
3.RAL-LNE与RAL-NNE在SD大鼠在体单向肠灌流的吸收机制。(1)RAL-LNE在小肠的四种肠段中Ka及Peff的由大到小顺序为:空肠＞十二指肠＞回肠＞结肠,且空肠的吸收程度与任何其它肠段相比均有显著性的差异(P＜0.05)。(2)在SD大鼠在体单向肠灌流条件下,RAL-LNE与RAL-NNE并无明显的差异(P＞0.05)。(3)三种抑制剂均导致RAL-NNE在SD大鼠空肠RAL吸收不同程度降低,其中制霉菌素抑制组对RAL-NNE抑制程度最大(Ka:3.28–3.91×10-2/min-1、Peff:2.83–3.36×10-3/cm·min-1),其次为氯丙嗪抑制组(Ka:3.30–4.74×10-2/min-1、Peff:3.14–4.15×10-3/cm·min-1),阿米洛利对空肠的RAL-NNE吸收抑制作用最低(Ka:10.45–11.47×10-2/min-1、Peff:11.07–12.41×10-3/cm·min-1);综合上述,说明RAL-NNE在SD大鼠空肠中涉及三种内吞方式进行吸收,既有网格和小窝蛋白介导,亦有巨胞饮介导的途径参与,但以小窝蛋白介导的内吞机制为主。
4.RAL-LNE与RAL-NNE的SD大鼠和五指山小型猪口服吸收。(1)SD大鼠中RAL-SUSP、RAL-NNE和RAL-LNE的Tmax分别为3.83±1.47、2.67±0.58和2.67±0.58;Cmax分别为0.24±0.12mg·L-1、0.38±0.05mg·L-1和0.72±0.26mg·L-1;AUC0-24h分别是2.12±0.45mg·h·L-1、4.36±0.93mg·h·L-1和4.31±0.57mg·h·L-1;Fa分别是7.01±1.49%、14.43±3.08%和14.25±1.88%。RAL-NNE和RAL-LNE的Fr分别是205.90±43.87%和203.30±26.89%;RAL-NNE与RAL-LNE显著提高了RAL的SD大鼠口服吸收,但两者之间无显著性差异(P＞0.05)。(2)五指山小型猪中RAL-NNE的三个Cmax分别为0.42±0.04mg·L-1、0.43±0.06mg·L-1和1.04±0.11mg·L-1,对应的Tmax分别是1.33h、4h和24h;RAL-LNE的三个Cmax分别为0.54±0.05mg·L-1、0.26±0.05mg·L-1和0.46±0.10mg·L-1,对应的Tmax分别是2h、5h和24h;而RAL-SUSP的Cmax为0.56±0.08mg·L-1,对应的Tmax为1h;RAL-SUSP、RAL-NNE与RAL-LNE的AUC0-36h分别为3.44±0.72mg·h·L-1,18.62±1.21mg·h·L-1和7.92±0.36mg·h·L-1。RAL-SUSP、RAL-NNE与RAL-LNE的Fa分别为4.22±0.89%、22.88±1.49%和9.73±0.44%;RAL-NNE与RAL-LNE的Fr分别为541.85±35.33%和230.32±10.49%;RAL-NNE与RAL-LNE均显著提高了RAL的五指山小型猪口服吸收,而且两者之间存在显著性差异(P＜0.05)。
结论:本文通过体内外的系统研究证明了NNE在胃肠道不被PPL脂解而保持其自身的完整性,从而RAL得到保护,避免了IFPM,五指山小型猪的生物利用度数据表明,与传统的LNE相比,进一步提高了口服RAL的口服吸收。
方法:1.RAL-NE处方优化。在RAL-LNE/NNE中含有的亚油酸(Linoleicacid,LOA)和棕榈酸异丙酯(Isopropyopalmitate,IPP)为非脂解油;大豆油(Soybeanoil,SBO)为脂解的油,乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor?RH40,RH40)、无水乙醇为助乳化剂,三者比例为3∶5∶2基础上,以RAL的载药量对处方进行优化,载药量通过RAL在预乳中的溶解度来确定,最后并对制备的NE进行粒径及分布、形态及稳定性进行评价。
2.RAL-LNE与RAL-NNE的体外代谢研究。(1)RAL-LNE、RAL-LNE与RAL-NNE加入在含猪胰脂肪酶(PPL)或不含PPL的体外脂解体系中脂解60min;(2)上述脂解体系加入到加入含UDP-glucuronosyltransferase1A10(UGT1A10)和1A8(UGT1A8)的体外代谢体系中,37℃无氧气浴,温孵120min;HPLC检测RAL及其代谢产物RAL-6-β-葡萄糖醛酸苷(R-M1)和RAL-4’-β-葡萄糖醛酸苷(R-M2)的含量,最后计算和对比不同制剂的RAL代谢率(W代谢,%)及R-M1和R-M2的生成率(W生成,%)。
3.RAL-LNE与RAL-NNE在SD大鼠在体单向肠灌流的吸收机制研究。(1)SD大鼠RAL-LNE在小肠的四种肠段(十二指肠、空肠、回肠与结肠)灌流120min,测定并计算RAL的有效渗透系数(Peff)和吸收速率常数(Ka),比较不同肠段吸收差异;(2)比较RAL-LNE与RAL-NNE吸收的差异;(3)SD大鼠肠道吸收机制研究,通过Ka及Peff比较三种胞饮的抑制剂(阿米洛利、氯丙嗪和制霉菌素)对RAL-NNE吸收的影响,探讨吸收机制。
4.RAL-LNE与RAL-NNE的SD大鼠和五指山小型猪口服吸收研究。(1)健康雌性SD大鼠,分别按45mg·kg-1灌胃给予RALC为2.25mg·mL-1的RAL-NNE、RAL-LNE和RAL-SUSP;以10mg·kg-1静脉注射RAL-SOL(4mg·mL-1RAL)。于规定时间眼眶取血0.4mL、离心分离血浆、HPLC测定RAL含量,计算各组制剂的生物利用度参数。(2)健康雌性五指山小型猪,给药前注射阿托品、舒泰和速眠新(1∶3)麻醉,按10mg·kg-1分别灌胃给予RALC为2.25mg·mL-1的RAL-NNE、RAL-LNE和RAL-SUSP,以1.67mg·kg-1静脉注射RAL-SOL(4mg·mL-1RAL),前腔静脉取5mL,离心分离血浆,HPLC测定RAL含量,计算各组制剂的生物利用度参数。
结果:1.RAL-NE处方优化。以RAL载药量为指标,对NE中各成分比例进行优化,获得了RAL-LNE和RAL-NNE最佳比例:混合油(LOA∶SBO/IPP=2∶1)∶RH40∶无水乙醇=5∶3∶2;在满足成乳性、24h稳定性、粒径(＜100nm)和PDI(＜0.2)的条件下,以辅料总C为0.067g·mL-1,RALC为2.25mg·mL-1的NE进行后续研究。
2.RAL-LNE与RAL-NNE的体外代谢。(1)RAL-SOL在UGT1A8及UGT1A10体外代谢体系中,RAL代谢率分别为57.41±0.86%和99.29±2.83%,R-M1与R-M2的生成率分别为20.61±0.33%,36.71±1.07%;(2)当RAL-LNE加入不含PPL的体外脂解体系中(即不脂解),然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率低(UGT1A8:-0.69±1.87%,UGT1A10:10.03±0.92%),而当RAL-LNE加入含有PPL体外脂解体系中(即脂解),然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率则大幅上升(UGT1A8:46.00±0.83%,UGT1A10:51.83±2.95%);(3)RAL-NNE加入不含PPL体外脂解体系中,然后再加入体外代谢体系时,RAL代谢率很低(UGT1A8:0.50±0.49%,UGT1A10:5.69±1.34%),RAL-NNE加入含有PPL体外脂解体系并进行体外代谢,发现与未脂解RAL-NNE的RAL代谢率变化并不大,UGT1A8及UGT1A10代谢率分别为5.70±1.45%(P＜0.001)和10.84±3.13%(P＜0.001)。体外研究表明,RAL-NNE确实起到了保护RAL不被代谢的作用。与RAL-SOL比较,体外代谢酶为UGT1A8时,经脂解后的RAL-LNE中RAL代谢率显著减少了11.41%(P＜0.001),而RAL-NNE中的RAL代谢率显著减少了51.71%(P＜0.001)。体外代谢酶为UGT1A10时,脂解后的RAL-LNE中的RAL代谢率显著减少了47.46%(P＜0.001),脂解后的RAL-NNE中的RAL代谢率显著减少达到88.45%(P＜0.001)。因此,在同等的体外代谢体系的条件下,UGT1A10对RAL各制剂的药物代谢作用均比UGT1A8更强。
3.RAL-LNE与RAL-NNE在SD大鼠在体单向肠灌流的吸收机制。(1)RAL-LNE在小肠的四种肠段中Ka及Peff的由大到小顺序为:空肠＞十二指肠＞回肠＞结肠,且空肠的吸收程度与任何其它肠段相比均有显著性的差异(P＜0.05)。(2)在SD大鼠在体单向肠灌流条件下,RAL-LNE与RAL-NNE并无明显的差异(P＞0.05)。(3)三种抑制剂均导致RAL-NNE在SD大鼠空肠RAL吸收不同程度降低,其中制霉菌素抑制组对RAL-NNE抑制程度最大(Ka:3.28–3.91×10-2/min-1、Peff:2.83–3.36×10-3/cm·min-1),其次为氯丙嗪抑制组(Ka:3.30–4.74×10-2/min-1、Peff:3.14–4.15×10-3/cm·min-1),阿米洛利对空肠的RAL-NNE吸收抑制作用最低(Ka:10.45–11.47×10-2/min-1、Peff:11.07–12.41×10-3/cm·min-1);综合上述,说明RAL-NNE在SD大鼠空肠中涉及三种内吞方式进行吸收,既有网格和小窝蛋白介导,亦有巨胞饮介导的途径参与,但以小窝蛋白介导的内吞机制为主。
4.RAL-LNE与RAL-NNE的SD大鼠和五指山小型猪口服吸收。(1)SD大鼠中RAL-SUSP、RAL-NNE和RAL-LNE的Tmax分别为3.83±1.47、2.67±0.58和2.67±0.58;Cmax分别为0.24±0.12mg·L-1、0.38±0.05mg·L-1和0.72±0.26mg·L-1;AUC0-24h分别是2.12±0.45mg·h·L-1、4.36±0.93mg·h·L-1和4.31±0.57mg·h·L-1;Fa分别是7.01±1.49%、14.43±3.08%和14.25±1.88%。RAL-NNE和RAL-LNE的Fr分别是205.90±43.87%和203.30±26.89%;RAL-NNE与RAL-LNE显著提高了RAL的SD大鼠口服吸收,但两者之间无显著性差异(P＞0.05)。(2)五指山小型猪中RAL-NNE的三个Cmax分别为0.42±0.04mg·L-1、0.43±0.06mg·L-1和1.04±0.11mg·L-1,对应的Tmax分别是1.33h、4h和24h;RAL-LNE的三个Cmax分别为0.54±0.05mg·L-1、0.26±0.05mg·L-1和0.46±0.10mg·L-1,对应的Tmax分别是2h、5h和24h;而RAL-SUSP的Cmax为0.56±0.08mg·L-1,对应的Tmax为1h;RAL-SUSP、RAL-NNE与RAL-LNE的AUC0-36h分别为3.44±0.72mg·h·L-1,18.62±1.21mg·h·L-1和7.92±0.36mg·h·L-1。RAL-SUSP、RAL-NNE与RAL-LNE的Fa分别为4.22±0.89%、22.88±1.49%和9.73±0.44%;RAL-NNE与RAL-LNE的Fr分别为541.85±35.33%和230.32±10.49%;RAL-NNE与RAL-LNE均显著提高了RAL的五指山小型猪口服吸收,而且两者之间存在显著性差异(P＜0.05)。
结论:本文通过体内外的系统研究证明了NNE在胃肠道不被PPL脂解而保持其自身的完整性,从而RAL得到保护,避免了IFPM,五指山小型猪的生物利用度数据表明,与传统的LNE相比,进一步提高了口服RAL的口服吸收。