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牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR),是由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,主要引起呼吸道和生殖道疾病,如传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、传染性脓疱性外阴道炎、流产等。自被发现以来,该病就在世界范围内流行,给养牛业造成巨大的经济损失。IBR被国际兽疫局(0IE)列为B类疾病,该病的根治方法是阳性牛检出与捕杀,而防制的主要措施是接种疫苗,主要采用基因工程疫苗的方法,国外也已相继开发出了牛疱疹病毒1型TK、gE基因缺失重组疫苗。BHV-1是有囊膜的双股DNA病毒,其基因组G+C含量为72%,大小约为138kb,由一个UL区(106kb)和一个US区(10kb)及US区两侧的重复序列(IRs和TRs,各1lkb,序列相同但方向相反)组成。BHV-1基因组编码70个左右基因,其中有10种为糖蛋白。其中gE糖蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白。它以细胞特异的方式影响病毒从被感染细胞中释放,同时gE基因的缺失也影响到病毒在细胞间的传播。而胸腺激酶(TK)基因是牛疱疹病毒1型增殖的非必需基因,也是主要毒力基因之一,对病毒在神经组织的持续感染具有非常重要的作用。本研究构建了牛疱疹病毒1型TK／gE双基因缺失突变株,并做了动物安全性和保护力试验,为研究缺失标志活病毒疫苗及研制表达外源基因的BHV-1重组病毒活载体疫苗奠定基础。主要工作包括：1.牛传染性鼻气管炎TK~-／gE~-基因双缺失突变株的构建1)牛传染性鼻气管炎TK-/EGFP+突变株的构建本实验以牛疱疹病毒1型全序列(基因登录号为AJ004801)为基础,提取病毒全基因组。在此基础上设计引物,用PCR技术扩增TK基因上游和下游约1.0 kb和1.1kb的片段作为同源重组臂,分别克隆于载体pBluescriptⅡSK(+)中。用相应的限制性内切酶将下游同源臂回收,定向插入到上游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF08-21。然后插入带有完整启动子的EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF07-16。以磷酸钙转染法将经线性化的pZF07-16、质粒pBICP0与BHV-1基因组DNA在牛肾细胞(MDBK)上共转染,成功地进行了同源重组,7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/EGFP+突变株。2)牛传染性鼻气管炎TK~-突变株的构建提取BHV-1 TK-/EGFP+突变株基因组,再次以磷酸钙转染法将经线性化的pZF08-21、质粒pBICP0与基因组DNA在MDBK上共转染,同源重组去掉EGFP荧光标签,经5轮纯化成功的获得了BHV-1 TK-突变株。3)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株的构建方法同1,用PCR扩增gE基因上游和下游约1.0kb和1.1kb的片段,分别克隆于载体pcDNA3.1(+)myc-His B中。通过限制性酶切将上游同源臂回收,插入到下游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF09-08。然后插入EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF09-15。以磷酸钙转染法将经线性化的pZF09-15、质粒pBICP0与BHV-1 TK"缺失突变株基因组DNA在MDBK细胞上共转染,成功地进行同源重组,经过7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/gE-/EGFP+突变株。2.牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株的安全性和保护力研究1)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛的安全性研究安全性研究包括三部分：接种试验、同居试验、再激活试验。接种试验和同居试验：将试验组按剂量分为105,106,107三栏,滴鼻免疫4X105、4X106、4X107PFU的双缺失突变株,另设空白对照组。另在各栏中同时喂养未接种的牛作为同居对照。测量试验牛的体温,观察精神状态和采食情况,采集检测样品。再激活试验：接种免疫28天后,连续3天以15mg／头的剂量肌肉注射地塞米松,以激活处于潜伏感染状态的病毒。试验证实了牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株具有很高的安全性。2)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛的保护力研究两月龄牛分别用4X105、4X106、4X107PFU的双缺失突变株免疫4周后,以4X107PFU BHV-1强毒攻击。同时设免疫DMEM的空白对照组。分别于攻毒后1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d和28d测量体温、采集检测样品。试验结果表明：牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛具有很强的保护力。总之,本研究表明,BHV-1 TK-/gE-可以作为候选疫苗毒株,为我国牛传染性鼻气管炎根除计划提供工具。