酒精是最常见的肝脏毒物之一,过量饮酒导致的肝脏损伤是一个世界性的医学难题。有资料表明,成年男性每天摄入乙醇的剂量>40g,女性摄入乙醇的剂量>20-30g,就可导致肝脏损伤。进入体内的乙醇,仅有2-10%通过肺脏和肾脏排出,其余大部分在肝脏中主要经胞浆中的乙醇脱氢酶、过氧化物酶体中的过氧化氢酶以及微粒体中的乙醇氧化酶系代谢为乙醛,再经过乙醛脱氢酶代谢为乙酸,进入三羧酸循环代谢为二氧化碳和水。乙醇代谢过程中引起机体氧化应激,氧化应激可以损伤线粒体,乙醇也可直接导致内质网应激,进而造成线粒体功能紊乱、脂质蓄积、炎症反应以及细胞凋亡。近年来,成人酒精中毒的发生率也逐年升高；长期饮酒可造成全身多系统的损伤、尤其对胃肠道,肝脏损伤更为明显,酒精可直接或间接引起慢性胃炎,消化性溃疡和酒精中毒性肝硬化。虽然近年来关于乙醇代谢的机制研究取得重大的进展,但防治方法和治疗措施并未有所进展,人们至今尚不能有效的防治乙醇摄入导致的临床问题和社会问题。灵芝蒜颗粒提取物由富硒灵芝提取物、大蒜提取物、麦芽糊精组成。现代药理和临床研究证明,灵芝对多种理化及生物因素引起的肝损伤有保护作用。无论在肝脏损害发生前还是发生后，服用灵芝都可促进肝脏对药物、毒物的代谢,保护肝脏,减轻肝损伤,具有显著的保肝作用；硒具有强大的抗氧化功能,比维生素E高500倍,因此富硒灵芝的很多生物学活性要优于普通灵芝；大蒜化学成分众多,既是一种免疫激发剂,也是一种强有力的抗氧化剂。大蒜油,大蒜素,大蒜多糖等对乙醇所致的肝损伤保护作用均有报道[3-41,其保护可能与清除自由基、抑制脂质过氧化作用等作用有关。这些报道提示了富硒灵芝、大蒜制品在对抗乙醇损伤防治中的潜在作用,根据解酒保肝产品的需求及现状,本课题组研制出以富硒灵芝大蒜为原料配方的灵芝蒜颗粒将具有广阔的市场,我们通过研究灵芝蒜颗粒的保肝护肝作用,以期为其保健功能评价、开发利用提供进一步的科学依据。目的：建立一次性乙醇摄入所致的酒精中毒模型和急性肝损伤模型,长时间乙醇摄入所致的慢性肝损伤模型,通过测定血清和肝脏相关指标以及观察组织病理学改变,评价灵芝蒜颗粒解酒保肝作用的效果及探讨机制。方法：1.将40只KM小鼠随机分成4组,每组10只,分别为对照组、LZS高、中、低剂量组,各剂量组灌胃不同浓度LZS,对照组给予生理盐水。连续7d,最后一次灌胃后各组小鼠灌胃给予50%乙醇0.018ml/g BW,计算醉酒时间和睡眠时间；选取SD大鼠随机分为对照组和给药组,给药组灌胃0.42 g/kg体质量LZS,模型组给予生理盐水。连续7d,最后一次灌胃后,各组大鼠灌胃给予50%乙醇0.014ml/gBW,分别于灌酒后30、120、180 min自尾部采血,采用气质联用色谱法检测小鼠血液中的乙醇浓度。2.将60只KM种小鼠随机分为6组,每组10只,分别为正常组、模型组、LZS(高、中、低剂量)组和阳性对照组,给药组灌胃给予不同剂量LZS,阳性组灌胃联苯双酯,模型组和正常对照组灌胃生理盐水,连续15d,除正常对照组灌胃给予生理盐水外,其余各组一次性灌胃给予50%乙醇12ml·kg-1 BW,处死小鼠采集血液样品和肝组织样品。测定血清转氨酶、甘油三酯(TG)及肝组织丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,并进行病理组织学观察。3.将75只大鼠,适应性喂养一周后,按体重随机分组为6组,依次为正常组(n=10),模型对照组(n=13),联苯双酯组(n=13),低剂量组(n=13),中剂量组(n=13),高剂量组(n=13),LZS高剂量组为0.42g/kg,中剂量组为0.21g/kg,低剂量组为0.11 g/kg,阳性组为0.00236 g/kg联苯双酯。每日上午9时给药组灌胃给予相应的药物剂量,模型组和正常对照组灌胃生理盐水,下午4时给予各组大鼠0.15ml/kg体质量红星二锅头。连续8周后,各组动物隔夜禁食16小时,处死动物,取血清,测定血清中谷草酰胺转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)含量；肝脏称重,一部分肝脏10%甲醛固定,进行肝脏病理学检测。另称取适量肝组织,制备10%肝组织匀浆,测定肝匀浆中利用试剂盒测定肝匀浆中丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量；采用差速离心法制备肝微粒体,测定细胞色素CYP2E1、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性。结果：1.小鼠睡眠实验表明：LZS三剂量组可不同程度延长小鼠醉酒时间,缩短睡眠时间。尤以高剂量为佳,与模型组相比可显著延长小鼠醉酒时间(P<0.05),缩短睡眠时间(P<0.05)；气质联用仪测定大鼠酒后血中乙醇含量显示：给药组各时间点乙醇血药浓度均小于对照组,其中120min、180 mmin与对照组相比有显著性差异(P<0.01),给药组药时曲线峰面积小于对照组。表明LZS具有很好的解酒作用。其机理可能通过减少乙醇的吸收.加速乙醇在体内的代谢和排泄有关等。2.急性酒精性肝损伤实验表明：灵芝蒜颗粒各治疗组不同程度的降低小鼠血清中ALT,AST和MDA含量,升高GSH水平,其中高剂量组与模型组相比,小鼠血清ALT、TG、MDA显著降低(P<0.01, P<0.05, P<0.05), GSH含量显著升高(P<0.01)；中剂量组与模型组相比,小鼠血清ALT含量显著降低(P<0.05),GSH含量显著升高(P<0.01)；低剂量组与模型组相比小鼠肝匀浆GSH含量显著升高(P<0.01)。肝脏病理组织学观察显示：模型组肝小叶中央静脉扩大,肝窦淤血和出血,肝细胞明显肿胀,弥漫性肝细胞脂肪变性。阳性对照组肝小叶的组织结构基本接近正常,肝细胞未见明显肿胀,肝细胞索排列整齐,但仍可见少量充血；低剂量组肝细胞肿胀,大量肝细胞脂肪变性；中剂量组中央静脉周围部分肝细胞脂肪变性,病变范围变小,肿胀程度减轻；高剂量组肝小叶排列较齐,未见明显的窦腔狭窄,偶见散在肝细胞脂肪变性。病理组织形态学观察提示,灵芝蒜颗粒对酒精所致小鼠肝脏脂质过氧化损伤具有一定的保护作用,尤以高剂量组最佳,说明该药对急性酒精性肝损伤有治疗作用,其对酒精性肝损伤保护作用的机理可能是抗氧化和清除自由基。3.慢性酒精性肝损伤实验表明：大鼠摄入酒精45天后,大鼠体重显著性降低(P<0.05),血清中AST、ALT和以及肝组织中MDA显著增加(P<0.01)。LZS干预可显著缓解酒精伤害,尤其高剂量组为佳,与模型组相比,大鼠体重显著回升(P<0.01),表明高剂量组可显著性拮抗酒精性肝损伤引起的体重降低；大鼠血清ALT、AST、TG、HA、LN、TNF-α、SOD、GSH-px含量显著降低(P<0.05, P<0.01, P<0.01, P<0.01, P<0.01, P<0.01, P<0.05, P<0.05);大鼠血清和肝组织MDA显著降低(P<0.01)、GSH含量显著升高(P<0.01)；大鼠肝微粒体CYP2E1活性降低(P<0.01), GSH-px含量显著升高(P<0.01)。肝脏病理石蜡切片观察显示：模型组大鼠的肝组织病理损伤严重,肝细胞明显肿胀,胞质疏松,胞质内可见大小不一、数量不等的脂滴并伴有气球样变以及细胞水肿,肝小叶结构紊乱,小叶内有点状的坏死；低剂量组大鼠的肝细胞明显肿胀,胞质内可见大小不一,数量不等的并伴有气球样变以及细胞水肿,肝小叶结构紊乱；中剂量组鼠的肝细胞肿胀,胞质内可见少量的脂滴并伴有轻微的气球样变,肝小叶结构基本,完整；高剂量组；大鼠肝细胞、肝小叶结构基本正常,这表明灵芝蒜颗粒能缓解酒精伤害,可明显减轻酒精对机体脂质代谢和抗氧化系统的不利影响。结论：采用睡眠试验、测血液中乙醇含量来研究灵芝蒜颗粒解酒效果,结果表明,LZS可不同程度的延长小鼠醉酒时间,缩短睡眠时间,以高剂量为最佳；LZS可有效地降低不同时间点血液中的乙醇浓度,从根本上缓解急性酒精中毒的症状,其机制与减少乙醇的吸收/加速乙醇在体内的代谢和排泄等有关。单次酒精灌胃造成急性酒精性肝损伤,肝脏脂质过氧化随时间延长而逐渐增加,证实氧化应激参与了急性酒精性肝损伤,并且是一个逐渐累积的过程。此外,非酶抗氧化物GSH含量、抗氧化物酶SOD活性均显著降低,提示早期抗氧化系统的损伤加剧了氧化应激。灵芝蒜颗粒可抑制酒精引起的氧化应激,表现为显著减轻脂质过氧化。此外,灵芝蒜颗粒还可恢复GSH含量以及SOD的活性。因此可以推测灵芝蒜颗粒减轻急性酒精性肝损伤导致的氧化应激可能与其保护抗氧化防御系统,从而促进ROS有效清除有关。大鼠长期摄入酒精可导致慢性酒精性肝损伤,在肝细胞中,酒精诱导肝脏病理变化包括肝肿大和血清学变化,伴随着血清中AST,ALT的显著增加。LZS能使肝指标回复到正常水平,高剂量效果更加显著；酒精摄入能导致血清和肝组织中甘油三酯水平显著上升,LZS各组能改善不良效果,与酒精处理组比较,LZS各组能显著降低血清和肝组织的TG水平；脂质过氧化指标MDA也显著降低。LZS各组可降低MDA的合成；抗抗氧化物酶GSH-Px和SOD显著升高,均在正常范围；慢性肝损伤伴有部分肝纤维化出现,LZS各组能使肝损伤模型大鼠血清HA及LN显著降低。通过观察灵芝蒜颗粒对一次性乙醇摄入和长时间乙醇摄入的干预调节作用,表明LZS具有良好的解酒保肝作用。