研究背景胎龄32周以下的极早产儿或出生体重1500g以下的极低出生体重儿是死亡率、并发症和后遗症发生率最高的人群。感染性疾病如晚发性败血症、感染性肺炎、坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis, NEC)以及其他炎症反应相关性疾病如支气管肺发育不良(Bronchopulmonary Dysplasia, BPD)、严重脑室内出血(Intraventricular hemorrhage,IVH)、脑室周围白质软化等疾病的发生率较其他早产儿及足月儿高。这些早产儿出院后1岁以内的再入院率和感染率以及过敏性疾病如特异性皮炎、哮喘等的发生率也远高于足月儿。感染性和过敏性疾病的高发不仅影响这些高危婴儿的生存率及生活质量,也显著增加了家庭和社会的经济负担。对感染性或过敏性疾病的易感提示这些高危早产儿免疫功能的异常(抑制或高敏状态),因此充分了解极早产儿的免疫功能状态,将有助于寻找促进其免疫功能成熟和平衡的方法以预防免疫相关性疾病,提高极早产儿的生活质量。免疫细胞是具体执行免疫功能的免疫成分,而淋巴细胞则是最主要的免疫细胞。淋巴细胞亚群中的自然杀伤(Natural killer, NK)细胞以及固有淋巴细胞是固有免疫细胞的重要组成部分,主要参与固有或先天性免疫应答,而T淋巴细胞(简称T细胞)和B淋巴细胞(简称B细胞)则是参与适应性免疫应答的关键细胞。T细胞主要介导细胞免疫应答,依据T细胞表面标志及功能特征,又可将T细胞分为不同亚群,TCR、CD3和CD2是成熟T细胞各亚群的共同标志。根据T细胞表面CD4和CD8表达,成熟T细胞可分为CD2+CD3+CD4+CD8-和CD2+CD3+CD4-CD8+T细胞,简称CD4+T细胞(即辅助性T细胞,Th细胞)和CD8+T细胞(即杀伤性或抑制性T细胞,Tc或Ts细胞)。B细胞是机体产生抗体的细胞,主要执行体液免疫,并具有抗原提呈功能,主要表面标志为CD19、CD21、 CD81等。NK细胞是不同于T和B细胞、具有直接杀伤靶细胞效应的一类淋巴细胞,靶细胞包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞,主要表面标志为CD16和CD56,其它还有CD57和CD2、CD7、CD8等。成人外周血中一般B细胞占淋巴细胞总数的10%-15%,T细胞占60%左右,NK细胞则占10%-15%。一般认为,新生儿出生时的免疫细胞数量和比例远低于成人,适应性免疫的成熟则是在出生后逐渐建立的,这也是新生儿对感染性疾病易感的原因之一。与足月儿相比,早产儿更为脆弱,因缺乏孕后期经胎盘转运的IgG及抗原刺激,早产儿出生时主要依靠先天性免疫发挥抗感染作用。多位学者对不同胎龄新生儿出生时的淋巴细胞亚群状态进行过研究和比较,普遍认为,与足月儿相比,早产儿多种先天性免疫细胞如NK细胞的绝对和相对数量减少。出生时免疫细胞数量的减少或功能的减弱可能是这些不成熟儿随后易发生感染性疾病的一个原因,但有关早产儿特别是极早产儿出生时及出生后的淋巴细胞免疫状态尚缺乏详细研究。出生后与免疫或炎症反应相关的疾病如晚发型败血症、BPD、IVH等与淋巴细胞亚群的关系也鲜有报道。目前对早产儿淋巴细胞亚群的研究存在以下不足：样本量少；缺乏极早产几长期随访研究；缺乏对出生时及出生后的多因素分析及与疾病相关性分析。本研究以胎龄32周以下的极早产儿为主要研究人群,其他早产儿和部分足月儿、婴幼儿数据为对照,进行回顾性和前瞻性队列研究,主要观察的结局变量为淋巴细胞亚群绝对计数和百分比,随访时间点包括出生24小时内、7天、14天、28天和6月左右,影响因素包括围产期因素和住院期间的疾病因素。主要目的是详细描述极早产儿出生时及出生后6月内淋巴细胞亚群绝对计数和相对计数(百分比)的水平及其影响因素和与疾病的相关性(临床意义),具体包括：1.通过详细描述不同胎龄段新生儿出生时以及不同年龄段幼儿的淋巴细胞亚群绝对计数及百分比水平而明确早产儿,特别是极早产儿出生时的免疫状态；并可作为不同胎龄和年龄段的计数参考；2.观察围产期因素对早产儿出生时淋巴细胞亚群水平的影响；3.研究极早产儿出生时淋巴细胞亚群水平与住院期间发生晚发性感染的相关性；4.观察极早产儿6月内淋巴细胞亚群水平的演变及与围产因素和重要疾病的相关性；5.观察极早产儿Th1/Th2及Th17细胞百分比水平的演变及影响因素。研究假设包括：早产儿出生时及出生后的淋巴细胞亚群水平低于足月儿和健康婴幼儿并可能受多种围产因素影响；极早产儿出生后淋巴细胞亚群水平会逐渐升高,并可能与多种疾病相关。在充分阐述早产儿淋巴细胞亚群水平及其影响因素的基础上,本研究将为促进早产儿免疫功能和疾病预防提供依据。第一部分早产儿出生时淋巴细胞亚群水平及影响因素研究目的：通过比较不同胎龄段新生儿出生时以及不同年龄段婴幼儿的淋巴细胞亚群绝对计数及百分比水平,观察早产儿出生时淋巴细胞亚群水平,同时探讨围产期因素对早产儿出生时淋巴细胞亚群水平的影响。方法：本研究为回顾性队列研究,纳入人群为胎龄37周以下、出生3小时以内、围产信息齐全的早产儿。符合以上标准的156例早产儿根据胎龄分为3组：23～28w组(27例,胎龄28周以下,不包括28周)；28～32w组(68例,胎龄≥28周,小于32周)；32～37w组(61例,胎龄≥32周,小于37周)。另外以胎龄37～42周的健康足月新生儿23例,0～1岁健康婴儿20例,1～3岁健康幼儿17例,3～6岁26例作为对照。利用六色流式细胞检测方法检测并比较新生儿出生时脐血或外周血及幼儿体检时外周血淋巴细胞及其亚群T细胞、辅助性T(Th)细胞、抑制性T(Ts)细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞绝对计数和百分比。记录早产儿围产期信息并进行围产因素与淋巴细胞亚群水平的相关性研究。结果：与健康足月新生儿和婴幼儿相比,所有早产儿出生时除B细胞外的淋巴细胞亚群绝对计数均有显著下降(P<0.05)；23-32周的早产儿淋巴细胞、B细胞百分比相对较高,而T细胞、Th细胞、Ts细胞百分比与足月儿大致相当。28周以下的超早产儿NK细胞百分比和绝对计数在所有胎龄和年龄段内最低。而不同胎龄的早产儿之间相比,淋巴细胞亚群绝对计数均无统计学差异(P均>0.05)；除淋巴细胞和B细胞外,其余各亚群百分比均无显著差异。相关性分析表明,NK细胞计数及百分比与胎龄、出生体重均呈显著正相关,而B细胞计数和百分比、淋巴细胞百分比均与胎龄和出生体重呈负相关。对早产儿淋巴细胞亚群进行多元线性回归分析表明：胎龄对淋巴细胞百分比和B细胞计数表现为负向影响；出生体重对T细胞、Th细胞为正向影响,对B细胞百分比有负向影响；男性早产儿相对女性Ts细胞百分比和B细胞绝对计数升高；产前激素对T细胞和Ts细胞百分比呈正向影响,对NK细胞计数和比例均呈负向影响；而宫内感染可促进B细胞比例、抑制T细胞比例的增加；1分钟Apgar评分越高则B细胞计数越高。结论：早产儿出生时淋巴细胞亚群水平显著低于足月新生儿和婴幼儿,但各早产儿组之间的差异并不十分显著；早产儿淋巴细胞亚群水平受多种围产因素影响,提示早产儿对感染的高易感性除因先天性免疫功能不足外,可能是多种因素综合影响的结果。早产儿出生时B细胞比例升高、T细胞比例下降提示宫内感染可能。第二部分极早产儿出生时淋巴细胞亚群水平与晚发型感染的相关性研究目的：早产儿出生时先天性免疫细胞水平与晚发型感染的关系尚未被完全阐明,本研究的目的是观察极早产儿出生时淋巴细胞亚群水平与住院期间发生晚发型感染的相关性。方法：选取住院时间超过7天的84例胎龄32周及以下的早产儿为研究对象,根据是否发生晚发型感染分为感染组和非感染组,晚发型感染定义为出生72小时后发生的细菌性感染(包括晚发型败血症、脑膜炎、医院获得性感染性肺炎以及其他感染)。采用流式细胞术检测早产儿出生3小时内脐带血或静脉血进行淋巴细胞及其亚群T细胞、辅助性T(Th)细胞、抑制性T(Ts)细胞、自然杀伤(NK)细胞、和B细胞绝对计数和百分比,记录晚发型感染发生情况。结果：84例极早产儿中,33例发生晚发型感染,45例胎龄≤30周的早产儿中有27例发生晚发型感染。极早产儿感染组较未感染组NK细胞的绝对计数和百分比均显著下降,但胎龄和体重也相对较低。进一步对龄≤30周早产儿进行分层分析,发现感染组NK细胞百分比依然显著低于未感染组(P<0.01)。结论：本研究表明早产儿出生时NK细胞比例减少可能增加以后发生感染的风险,对这一类早产儿需格外重视以预防感染性疾病。第三部分 极早产儿出生后淋巴细胞亚群演变及其与围产因素和临床疾病的相关性研究目的：了解极早产儿淋巴细胞亚群出生后6月内的发育趋势,探讨围产因素对极早产儿出生后6月内淋巴细胞亚群水平的影响及其和疾病的相关性。方法：本研究为极早产儿前瞻性队列研究。研究对象为胎龄<32周且出生体重<1500g、入院日龄<24小时、住院时间28天以上的极早产儿61例。采用流式细胞术检测早产儿出生24小时内(第1天)、第7、14、28天及6月时的淋巴细胞及其亚群T细胞、辅助性T(Th)细胞、抑制性T(Ts)细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞绝对计数和百分比。对比极早产儿各淋巴细胞亚群绝对计数和百分比在不同时间点的差异,并与婴幼儿结果比较；分析各围产因素(胎龄、出生体重、性别、生产方式、胎膜早破、宫内感染、UU定植、产前肾上腺皮质激素)及疾病因素(晚发型败血症、BPD、严重IVH、胆汁淤积)对极早产儿淋巴细胞亚群绝对计数和百分比在不同时间点的相关性。结果：极早产儿出生时除NK细胞外的各淋巴细胞亚群绝对计数均处于最低水平,但1周时即迅速升高,经过7～28天的平稳期后,至生后6月,又有显著上升,6月左右达到与0～1组健康婴儿相当的最高水平,健康幼儿淋巴细胞亚群计数水平则随着年龄增长自1岁后又逐渐下降。NK细胞计数一直维持在较低水平,6月时才明显超过出生水平。在比例方面,淋巴细胞、B细胞百分比随着日龄逐渐升高,6月时达到与0～1岁婴儿组相当的最高水平,健康幼儿自1岁后又逐渐下降。T细胞、Th细胞在出生后总体表现为下降趋势,T细胞百分比在6月时降至与0～1岁组婴儿相当的最低水平,而NK细胞比例出生后下降,1周左右降至最低,此后逐渐回升,以3～6岁组最高,但总体维持在较低水平(5%～10%)。以胎龄是否大于28周分为极早产儿组和超早产儿组,出生第1天两组间无论绝对计数还是百分比均无显著差异,但自生后第7天起,超早产儿组T细胞、Th细胞、NK细胞计数的上升速度落后于极早产儿组(P<O.05),这种效应持续至生后28天,而B细胞计数在第7天时高于极早产儿组(P<0.05)；T细胞、淋巴细胞百分比分别于第7天、14天时低于极早产儿组,至生后28天时淋巴细胞百分比依然较低(P<0.05),此后两组间无论计数还是百分比不再有差异。男婴在第1至28天的T、Th细胞水平显著低于女性婴儿,B细胞水平则高于女性；剖宫产婴儿6月时的T细胞百分比高于阴道分娩婴儿；产前应用肾上腺皮质激素使极早产儿14天的淋巴细胞所有亚群计数均高于未用激素者；胎膜早破仅对出生第1天的淋巴细胞亚群有影响；而宫内感染对生后7、14、28天的T和Th细胞有抑制作用,对7、14天的B细胞有促进作用。与对照组相比,出生第1天UU定植组淋巴细胞、T、Th、Ts细胞以及14天的B细胞绝对计数水平显著升高。在控制了混杂因素后,晚发型败血症对各时间点的淋巴细胞亚群计数水平无显著影响；BPD组极早产儿在14天时T和Th细胞百分比显著低于非BPD组,而B细胞计数及比例则显著高于对照组：与对照组相比,严重颅内出血组7-28天间的T、Th、NK细胞水平显著下降,而B淋巴细胞百分比则在28天时显著升高；28天时胆汁淤积组T细胞绝对计数显著低于对照组。结论：极早产儿虽然出生时先天性免疫细胞数量不足,但出生后会逐渐发育和扩增,6月左右达到健康婴儿水平。不同胎龄的极早产儿出生时淋巴细胞亚群水平相差不大,但出生以后则逐渐表现出差别,即胎龄越低,则生后1月内的上升幅度越低,至生后6月左右,两组间各免疫细胞水平已无明显差别。早产相关的多种围产因素对其出生后的淋巴细胞亚群水平会有较长时间的影响。而出生后的多种疾病包括BPD、严重颅内出血、胆汁淤积等可能与某种或多种淋巴细胞亚群水平的变化有相关性。第四部分极早产儿出生后Th1、Th2、Th17细胞演变及影响因素研究目的：了解极早产儿Th细胞亚群中Th1、Th2以及Thl7细胞在出生后6月内的发育趋势,探讨围产及临床因素对极早产儿出生后6月内Th1/Th2以及Th17细胞百分比的影响。方法：本研究为极早产儿前瞻性队列研究。研究对象为胎龄<32周且出生体重<1500g、入院日龄<24小时、住院时间28天以上的极早产儿61例。采用流式细胞术检测早产儿出生24小时内(第1天)、第7、14、28天及6月时的Thl、Th2以及Th17细胞百分比。同时收集28天之前的嗜酸性粒细胞计数与百分比数据。对比极早产儿以上各细胞百分比在不同时间点的差异；对比与文献报道健康足月新生儿脐血Th1、Th2和Th1/Th2比值的差异；分析各临床因素与极早产儿Th1/Th2以及Th17细胞水平在不同时间点的相关性。结果：极早产儿出生时Th1/Th2和Th17细胞比例都非常低,Th17细胞百分比在14天前几乎没有变化,至28天时才有上升,此后又略有下降,比例一直未超过0.2%。与文献报道的健康足月新生几脐血结果相比,极早产儿出生第1天Th1、Th2无显著差异,但Th1、Th2比值显著低于足月儿。Th1/Th2细胞百分比一周前均无明显变化,Thl细胞1周后缓慢上升,28天后明显升高,6月时达4周水平的2倍左右；Th2一周后略有上升,14及28天时均超过出生及7天时水平,28天后又略有下降。Th1、Th2比值在4周之前一直波动在1.0左右,4周后开始上升,6月时接近2.5,与足月儿脐血结果相当。围产因素如胎龄、体重、生产方式、产前激素应用、宫内感染以及出生后益生菌使用与否、高嗜酸性细胞血症等对Th1/Th2 Th1/Th2比值及Th17细胞水平均无明显影响。晚发性败血症早产儿在7、14天的Th17细胞比例均高于对照组。Th2细胞与嗜酸性粒细胞百分比无显著相关性。结论：极早产儿出生后Th1/Th2显著低于足月儿,但可逐渐升高；晚发性败血症发生可能与Th17细胞活化有关。