【摘 要】
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[目 的]小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）是一种恶性度极高的神经内分泌肿瘤,死亡率在肺部恶性肿瘤中位居第一,化疗占有治疗的主导地位,但多数患者一线化疗平均5个月将会耐药,因此,研究SCLC化疗耐药分子机制对改善患者预后具有重要意义。本项目团队前期通过微小RNA测序发现部分SCLC耐药患者血浆中microRNA-369-5p升高,且在多药耐药H69AR小细胞肺癌细
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860488）；
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[目 的]小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）是一种恶性度极高的神经内分泌肿瘤,死亡率在肺部恶性肿瘤中位居第一,化疗占有治疗的主导地位,但多数患者一线化疗平均5个月将会耐药,因此,研究SCLC化疗耐药分子机制对改善患者预后具有重要意义。本项目团队前期通过微小RNA测序发现部分SCLC耐药患者血浆中microRNA-369-5p升高,且在多药耐药H69AR小细胞肺癌细胞株中表达上调。目前microRNA-369-5p在SCLC中尚未见研究报道,本项目拟研究microRNA-369-5p对SCLC细胞株耐药的促进作用并初步探讨其内在分子机制。[方法]1.对小细胞肺癌亲本细胞株 H446及 SBC-5细胞分别瞬转microRNA-369-5p mimics 或 microRNA-369-5p inhibitor,差异化过表达和敲低microRNA-369-5p,通过定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证转染是否成功,确定合适的转染条件。2.联合顺铂或依托泊苷药物处理下,通过MTS实验、平板克隆实验、FITC偶联Annexin-V-PI染色+流式细胞分析（flow cytometry,FCM）和蛋白质印迹（Western blot,WB）实验,观察microRNA-369-5p对SCLC细胞的存活、凋亡能力的影响,从而明确microRNA-369-5p在SCLC细胞耐药方面的作用。3.从Starbase数据库下载microRNA-369-5p的预测靶基因集,通过GO功能富集分析可能受microRNA-369-5p调控的通路和功能,结合文献调研,筛选microRNA-369-5p促进耐药最可能作用的通路,并通过WB验证通路上关键蛋白的表达变化（推测为Notch通路）。4.采用 Notch 小分子抑制剂 IMR-1（Inhibitor of Mastermind Recruitment-1）阻断Notch信号转导,通过MTS和FITC偶联AnnexinV-PI染色+FCM实验,检测microRNA-369-5p促进SCLC耐药的作用能否被IMR-1挽救;并采用WB实验验证抑制剂对Notch通路的抑制效果。[结 果]1.研究结果示:在小细胞肺癌细胞系H446和SBC-5细胞中,采用mimics过表达microRNA-369-5p使其表达水平较对照组明显升高（大于2倍）,采用inhibitor敲低microRNA-369-5p使其表达水平较对照组明显降低（小于1/2）。该部分结果说明该转染条件下（microRNA-369-5p oligo 2μl,GP-transfect-mate 8μl）,能有效敲低、过表达microRNA-369-5p。2.研究结果示:在H446和SBC-5细胞中,敲低microRNA-369-5p后细胞对顺铂或依托泊苷敏感性增加,表现为细胞存活减少、细胞凋亡增加;而过表达microRNA-369-5p后细胞对顺铂或依托泊苷抵抗,表现为细胞存活增加、细胞凋亡下降。该部分结果表明microRNA-369-5p可通过促进H446和SBC-5细胞存活、抑制细胞凋亡从而诱导化疗抵抗。3.研究结果示:对microRNA-369-5p的预测靶基因集进行GO功能富集分析,发现microRNA-369-5p可以正调控Notch等通路;通过WB实验验证表明,敲低microRNA-369-5p可以抑制H446和SBC-5细胞中Notch-1蛋白表达,而过表达microRNA-369-5p则可以上调Notch-1蛋白表达。该部分结果表明microRNA-369-5p可以促进H446和SBC-5细胞Notch通路激活。4.研究结果示:采用Notch转录复合体抑制剂IMR-1阻断Notch转录激活,WB实验验证表明,IMR-1确实可以阻断过表达microRNA-369-5p诱导的Notch-1及其下游蛋白HES1表达上调;同时,加入Notch抑制剂IMR-1可以明显挽救microRNA-369-5p介导的H446和SBC-5细胞的化疗抵抗,细胞存活下降、细胞凋亡增加。该部分结果提示microRNA-369-5p通过激活Notch通路促进SCLC耐药。[结 论]本研究发现microRNA-369-5p可促进小细胞肺癌细胞存活、抑制细胞凋亡,进而促进小细胞肺癌细胞耐药,其机制可能是通过激活Notch通路发挥作用,但如何激活Notch-1和具体分子靶点有待进一步研究。该研究可能为临床小细胞肺癌耐药治疗提供靶点。
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