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【目的】阿尔茨海默氏病(Alzheimers Disease,AD)是一种随着世界人口年龄的增长而递增的神经退行性紊乱。导入早老素1(presenilin 1,PS1)的动物模型能表现出与人类AD患者相似的病理特征。为进一步阐明AD的发病机理及为治疗AD提供动物模型,本研究拟构建国内首例人类PS1突变型(PS1AE9)转基因小鼠,并对其进行一系列鉴定。为了进一步探索AD治疗的新方法,我们将TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因注入正常昆明白小鼠第四脑室,检测一系列基因表达水平的变化并初步观察其安全性。
【方法】用显微注射的方法将PrP-PSlAE9片断注入C57(♀)和DBA(♂)杂合受精卵的雄原核中。采用PCR、Southem Blot、RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot、免疫组化、H/E染色和行为学方法检测转基因阳性小鼠。另外从人类基因组中克隆trail基因,构建质粒pAAV-TRAIL,注射到昆明白小鼠第四脑室,采用RT-PCR和H/E染色检测一系列基因的表达水平和大脑病理情况。
【结果】显微注射后受精卵的完整率、幼仔的出生率和外源基因的整合率分别为79.59[％]、7.44[％]和1.03[％];通过PCR和Southem杂交成功检测出4只PrP-PS1AE9转基因阳性小鼠;RT-PCR和Real-TimePCR结果显示在转基因阳性鼠的大脑中表达人psl基因;Western杂交结果显示转基因阳性鼠的大脑中。PSl蛋白的表达量高于野生型小鼠;免疫组化结果显示在转基因阳性鼠的大脑皮质区和海马区的神经细胞胞浆中高表达PS1蛋白,而在野生型小鼠的大脑的皮质区仅见神经细胞胞浆有较弱PSI染色;H/E染色结果显示转基因阳性鼠的大脑结构非正常,神经纤维溶解,胶质细胞和淋巴细胞增生,神经细胞变性肿胀或坏死,并出现噬神经现象,而野生型小鼠的大脑海马和皮质区的结构基本正常;行为学分析结果显示转基因鼠及其F1代学习和记忆能力均低于野生型。hTRAIL注射后未见小鼠脑组织出现病理变化,RT-PCR结果显示BDNF、NT4、CD11b、CD11c、Nestin、SOX1、CNTF及GDNF的mRNA表达升高。
【结论】本实验采用显微注射的方法成功构建了PrP-PS1 E9转基因阳性小鼠,转基因小鼠脑中表达人类psl基因及其所编码的蛋白,具有与人类阿尔茨海默氏病相似的病理及行为学改变。hTRAIL注射后未见引起脑内病理改变，同时可能诱导小鼠脑组织神经干细胞表面标记，与神经元的定向分化相关标志分子以及神经系统的免疫修复功能相关分子的表达增加。