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研究背景和目的:肝细胞肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来HCC的诊断和治疗方法都有了明显进展,但其发病率和死亡率并没有显著改善。上皮-间充质转变(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是近年研究较为热门的话题,与肿瘤的侵袭、转移和肿瘤患者预后生存密切相关。随着EMT和VM研究的不断深入,抑制该过程的药物研究正逐渐升温。本研究旨在通过研究多西环素(doxycycline)对HCC中VM形成和EMT发生的抑制作用,初步阐明该药对HCC的抑制作用及其机制,进而为探索HCC治疗新途径提供实验依据。研究方法:1、通过HCC裸鼠移植瘤模型给药实验,观察并分析多西环素对HCC微循环模式,肿瘤增殖活性和动物生存期的影响。2、免疫组织化学染色和Endomucin/PAS双重染色方法计数HCC裸鼠移植瘤标本中微血管密度(MVD)和VM数量,并检测EMT相关蛋白白(表征蛋白E-cadherin,vimentin 和调控蛋白 Twist,Snail)和 VM 相关蛋白(VE-cadherin)表达,探讨多西环素与EMT,VM的关系。3、通过细胞增殖、粘附、迁移、侵袭实验和成血管塑形能力的体外研究,观察多西环素对HCC的抑制作用。4、通过 Western blotting,逆转录 PCR(RT-PCR),实时定量 PCR(real-time PCR),免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测HCC细胞系中多西环素对E-cadherin,vimentin,Twist,Snail,VE-cadherin表达的影响,从分子层面研究多西环素对HCC抑制作用的可能机制。5、转染并筛选出稳定降表达E-cadherin的HCC细胞,再加入多西环素,观察E-cadherin,vimentin,Twist,Snail,VE-cadherin 的表达情况,进一步阐明多西环素对VM形成和EMT发生的影响。6、通过甲基转移酶(DNMT)和基质金属蛋白酶(MMPs)活性的检测,及甲基化特异性PCR(MSP)对E-cadherin启动子区甲基化水平及非甲基化水平的检测,更深一步探索多西环素对VM形成和EMT发生可能存在的分子机制。结果:1、体内实验中,多西环素能抑制肿瘤生长,给药组和对照组肿瘤大小分别为:1.083 cm3和 1.991cm3(P<0.05),抑瘤率 43.39%。Kaplan-Meier 生存曲线表明多西环素能延长动物生存时间。2、多西环素给药组中,MVD和VM数量明显减少,E-cadherin表达较对照组高,vimentin,Twist,Snail,VE-cadherin 表达较对照组低。3、体外实验显示,多西环素能抑制肿瘤细胞克隆形成并抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞粘附,抑制肿瘤细胞迁移、侵袭,并抑制肿瘤细胞成血管塑形能力。4、Western blotting,RT-PCR,real-time PCR 及 IF 均显示多西环素能促进E-cadherin 表达并抑制 vimentin,Twist,Snail,VE-cadherin 表达。5、下调E-cadherin后再给药,E-cadherin仍然较下调组升高,vimentin,Twist,Snail,VE-cadherin较下调组降低。6、给药组DNMT及MMPs活性降低,MSP显示给药组E-cadherin启动子区甲基化水平降低,非甲基化水平升高。结论:1、HCC裸鼠移植瘤模型体内实验证实多西环素能抑制肿瘤生长,给药组肿瘤生长速度明显低于对照组;多西环素能延长动物生存时间,给药组动物生存时间较对照组延长。2、HCC裸鼠移植瘤体内模型实验和体外实验均证实多西环素能抑制VM的形成,和相关分子VE-cadherin的表达,并抑制EMT相关分子vimentin,Twist,Snail的表达,而促进E-cadherin的表达从而抑制VM形成和EMT发生。3、体外实验证实多西环素能抑制DNMT和MMPs等多种生物酶活性,并抑制CDH1启动子区甲基化,E-cadherin得以表达,从而抑制EMT的发生。