论文部分内容阅读
目的:探讨野黄芩苷（Scu）对脓毒症相关性急性肾损伤（SA-AKI）的保护作用及其机制。研究方法:（1）体内实验:将36只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为对照组、脂多糖（LPS）模型组、20 mg/kg Scu对照组及5、10、20 mg/kg Scu预处理组（Scu5、10、20+LPS组）,每组6只。采用腹腔注射10 mg/kg LPS法制备SA-AKI小鼠模型;对照组给予等量生理盐水;Scu 20对照组腹腔注射20 mg/kg Scu,持续1周;Scu预处理组于注射LPS前腹腔注射不同剂量Scu,持续1周。各组于LPS处理24h后处死小鼠取肾脏,观察肾组织损伤情况;采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测肾损伤标志物[肾损伤分子-1（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、白细胞介素-18（IL-18）和胱抑素C（Cys-C）]、核转录因子-κB（NF-κB）信号通路相关分子[IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、磷酸化p65和NF-κB抑制因子α（IκBα）]、凋亡相关蛋白[Bax和Bcl-2]及富含半胱氨酸蛋白61-结缔组织生长因子-肾母细胞瘤过表达基因1（CCN1）的蛋白表达。（2）体外实验:在未经LPS处理和经过100 g/L LPS处理后的HK-2细胞中,分别转染pc DNA3.1-CCN1过表达CCN1和小干扰RNA（si RNA）抑制CCN1表达,检测NF-κB信号通路相关分子、凋亡相关蛋白、CCN1等的m RNA及蛋白表达水平,观察CCN1是否参与了NF-κB信号通路激活和细胞凋亡;在转染和未转染CCN1 si RNA的HK-2细胞中加入100g/L LPS及20μmol/L Scu,观察Scu对LPS诱导的HK-2细胞损伤的保护作用及具体保护机制。结果:（1）体内实验:LPS诱导的AKI小鼠肾功能显著下降,肾小管严重受损;Scu可呈剂量依赖性缓解肾功能及组织学损伤。RT-PCR结果显示,Scu可呈剂量依赖性降低NF-κB信号通路相关分子表达,Scu 20+LPS组与LPS组比较差异有统计学意义[IL-1βm RNA(2-ΔΔCT):2.68±0.44比4.04±0.49,TNF-αm RNA(2-ΔΔCT):2.02±0.25比3.56±0.82,MCP-1 m RNA(2-ΔΔCT):2.09±0.38比4.21±0.70,均P＜0.05];Western blotting条带分析进一步证实,Scu预处理可呈剂量依赖性降低AKI小鼠肾组织中肾损伤标志物、NF-κB信号通路相关分子及CCN1的蛋白表达。（2）体外实验:Western blotting和RT-PCR结果显示,在经过LPS处理的HK-2细胞中,过表达CCN1可显著抑制炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA表达,LPS+CCN1-OE组与LPS组比较差异有统计学意义[IL-1βm RNA(2-ΔΔCT):3.20±0.57比4.88±0.69,TNF-αm RNA(2-ΔΔCT):2.98±0.44比5.00±0.81,MCP-1 m RNA(2-ΔΔCT):2.81±0.50比5.41±0.75,均P＜0.05],并使凋亡相关蛋白显著下调;当用si RNA抑制CCN1表达时,LPS+CCN1si RNA组炎症因子m RNA表达较LPS组上调[IL-1βm RNA(2-ΔΔCT):6.01±1.13比4.88±0.69,TNF-αm RNA(2-ΔΔCT):5.15±0.86比5.00±0.81,均P＜0.05],同时凋亡相关蛋白显著上调;在LPS诱导的HK-2细胞模型中,经过Scu处理后相关炎症因子m RNA表达显著下调,LPS+Scu组与LPS组比较差异有统计学意义[IL-1βm RNA(2-ΔΔCT):2.55±0.50比6.15±1.04,TNF-αm RNA(2-ΔΔCT):2.58±0.40比3.95±0.52,MCP-1 m RNA(2-ΔΔCT):2.64±0.44比6.21±0.96,均P＜0.05],且NF-κB信号通路相关分子及凋亡相关蛋白均显著下调;当用si RNA抑制CCN1表达时,LPS+CCN1si RNA+Scu组炎症因子m RNA较LPS+Scu组表达上调,差异有统计学意义[IL-1βm RNA(2-ΔΔCT):5.34±0.76比2.55±0.50,TNF-αm RNA(2-ΔΔCT):3.66±0.54比2.58±0.40,MCP-1 m RNA(2-ΔΔCT):5.15±0.79比2.64±0.44,均P＜0.05],且NF-κB信号通路相关分子及凋亡相关蛋白均显著上调,抑制CCN1减弱了Scu对LPS诱导的HK-2细胞损伤的保护作用。结论:Scu能保护AKI小鼠的肾功能,该保护作用与NF-κB信号通路和CCN1有关;Scu可能通过CCN1调节NF-κB信号通路以减轻LPS诱导的肾损伤。