近年来用眼过度、人口老龄化、环境恶化等因素,使眼科疾病的发病趋势愈来愈高。青光眼、角膜炎、结膜炎等许多眼内疾病,如不能得到及时和有效的治疗最终会导致反复发作甚至失明的严重后果。延长滞留时间,改善眼部生物利用度给药系统的研究,具有广阔的应用前景。眼部与机体其他部位相隔离,眼前段滴入式给药和后段侵入性给药是眼部疾患最常见的给药方式。眼睛的生理结构屏障及药物的理化性质限制了药物的透角膜吸收,使得角膜前半衰期短,生物利用度低。如何延长药物在角膜的滞留时间,提高给药后的有效生物利用度是眼部给药研究的热点和难点。黄芩苷眼用制剂临床多用于结膜炎、角膜炎、沙眼的治疗,对临床眼科常见病原菌有很强的抑菌杀菌作用。为满足药效需求,传统的黄芩苷眼用制剂临床治疗眼表或眼前段疾病时,多通过增加其药物浓度或给药频率等方式改善,但仍存在药物吸收量少的问题,大大地限制了药物临床的应用。脂肪乳载体具有降低血管刺激性和炎症反应,延长药物作用时间的优势。在体内脂肪乳具有一定的被动靶向性,能够增强药物的治疗效果成为难溶性药物优选载体。本课题将难溶性、不稳定的中药单体黄芩苷包载于脂肪乳的油相中,以达到增加制剂中难溶性药物载药量、改善物理稳定性的目的。磷脂作为脂肪乳的关键性辅料,其对产品的质量可产生显著影响。研究中选择生物相溶性好的磷脂为载体制备黄芩苷脂肪乳滴眼液,给药后在眼表形成"药物-泪液"膜,保障了脂质乳滴中药物不断向角膜细胞内传递的动力,延长药效起到缓释作用,使得眼科局部用药的优势得以发挥。本研究在对黄芩苷溶解性、稳定性研究的基础上,制备了以脂肪乳为载体的黄芩苷滴眼液,以不含脂质材料的亚微乳为对照,对比了不同载体黄芩苷的离体角膜透过性、眼内组织分布、眼前段消除动力学和房水内药物动力学等内容,同时对Labrasol和Transcutol P新型促渗剂对黄芩苷在不同载体中离体角膜透过性的影响、微透析探针在眼部应用可行性进行有益的探索,主要内容如下:1.黄芩苷理化性质研究①溶解性研究采用饱和溶解度法对34℃下黄芩苷溶解性及脂水分配系数进行测定,黄芩苷在水中的平衡溶解度为138±2.8μg·mL-1,在pH 2.0～7.4范围内,黄芩苷溶解度随着pH的增加而增大,呈弱碱性时溶解度最大。在水中加入不同类型乳化剂均可提高药物的溶解度,其中以Cremophor EL增溶效果最为明显,较水溶液提高约3倍,对于不同类型之间的乳化剂增加药物溶解度的作用不明显。脂水分配系数是影响黄芩苷转运速率和转运量的主要因素之一,而不同pH缓冲液中黄芩苷的lg P均<1,pH的改变并不能改变其亲脂性。②稳定性研究采用作图法,测定黄芩苷在不同温度、光照强度及Linger溶液中水解反应级数、反应速率常数、反应活化能,结果表明黄芩苷在45001x、直接光照和避光条件下,随着光照的增加,其降解速率也增加。不同温度下的反应呈一级降解速率,随着温度的升高,降解的趋势越明显,根据阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程,外推直线至25℃,可知黄芩苷损失10%所需要的时间(t0.9)为13.3 h。在Linger溶液中黄芩苷的降解不符合零级、一级、二级和三级反应模型。在此基础上,对黄芩苷酸性、弱碱性和碱性条件下的降解机制经行探究,结果表明,黄芩苷稳定性差,当pH大于3时即开始降解,因此在不考虑其它因素影响的前提下,制剂制备过程中需控制pH为3.0～4.0之间才能保证黄芩苷的稳定性。溶解性或稳定性中黄芩苷含量测定采用UV-Vis分光光度法或HPLC分析方法,所建立的方法简便、准确、灵敏度高,可作为黄芩苷含量测定的常用方法之一。2.以脂肪乳为载体制备黄芩苷滴眼液①脂肪乳滴眼液的制备采用单因素考察了影响体系稳定性、粒度分布、载药量和包封率的处方因素。最终确定以注射用大豆油、Poloxamer 188、丙三醇等生物相容性好、刺激性低的辅料制备黄芩苷脂肪乳滴眼液。所制备的滴眼液中黄芩苷的含量为1.31 ±0.01 mg·mL-1,粒径、PDI 和 ζ 电位分别为 107.3±4.39nm、PDI 为 0.089±0.044 和-(26.29±1.65)mV。②脂肪乳滴眼液的表征黄芩苷脂肪乳滴眼液为新型制剂,为了对处方中脂质材料的加入进行研究,实验中制备了不含脂质材料的O/W亚微乳剂作为参照,对二者进行表征。以外观、性状、载药能力、粒径分布范围和稳定性等为指标,采用透射电镜、纳米粒度/ζ电位分析仪等手段对两种制剂进行表征。结果表明按上述制备方法项下制得的脂肪乳滴眼液外观呈淡黄色、表面无油花、放置未出现黏壁现象;以适量水稀释后滴眼液呈淡蓝色乳光。采用透射电镜对二者整体形貌、乳滴的分布及聚集情况进行观察,结果表明,颗粒分布较为均匀,无明显黏连现象,脂肪乳为载体制备的滴眼液乳滴有类似于壳状结构将黄芩苷药物包载。采用强光、高温等破坏条件对黄芩苷不同制剂的稳定性进行考察,结果表明经4℃留样9个月,结果表明O/W亚微乳对黄芩苷稳定性的改变意义不大,而脂肪乳滴眼液中黄芩苷含量、粒径等均无明显变化。3.角膜透过性评价磷脂的双亲性能够通过角膜中水溶性物质屏障和脂溶性物质屏障,增加药物的角膜透过性。但影响药物角膜透过与处方及制备因素有关,角膜可供吸收的面积、厚度以及药物经膜孔道作用等生理因素有关,还与处方中促渗剂的种类及用量相关。本研究在脂肪乳的基础上,考察促渗剂加入对角膜透过性的影响。①新型促渗剂对角膜透过性的影响采用立式Franz扩散池法,以黄零苷水溶液为对照考察了 Labrasol和Transcutol P两种促渗剂对不同制剂角膜透过性的机制进行研究。结果表明,黄芩苷在Transcutol P中的溶解度较Labrasol好,且在水溶液中直接加入Labrasol,水化值超过83%,表明实验过程中Labrasol已对角膜上皮细胞和内皮细胞造成损伤。黄芩苷的表观渗透系数随着Transcutol P浓度增加,水溶液中呈现升高的趋势,而亚微乳中并未呈升高的趋势。②离体角膜透过性评价采用离体角膜法对不同制剂透过性及体外释放模型进行拟合。结果表明:Transcutol P对黄芩苷O/W亚微乳滴眼液及黄芩苷脂肪乳滴眼液的表观渗透系数的改善作用不明显。当Labrasol的浓度较低时,黄芩苷的表观渗透系数随Labrasol浓度增加而增加,当Labrasol过量存在时,黄芩苷的表观渗透系数随Labrasol浓度的增加而不再增加,达到平衡。体外释放拟合结果显示,黄芩苷在O/W型亚微乳滴眼液中较接近一级释放模型方程,而在脂肪乳滴眼液中黄芩苷的释放更接近Higuchi和Riger-Peppas方程。近一步说明黄芩苷在亚微乳中不同相分布可改变其释放模型。4.眼内分布及刺激性评价①不同黄芩苷制剂在眼内的分布以家兔为实验对象,摘取眼球分离各组织。对黄芩苷在眼内不同组织中的药物分布进行研究。结果表明,黄芩苷O/W亚微乳滴眼液和黄芩苷脂肪乳滴眼液可以显著延长黄芩苷在眼内的循环时间,提高除晶状体之外眼部组织中的药物浓度,脂肪乳组滴眼液和亚微乳组滴眼液的浓度分别为水溶液滴眼液的26.2倍和7.8倍,在0.5h时角膜中的药物分布分别为16.67倍和7.37倍。在8h时脂肪乳滴眼液组在巩膜中的药物滞留量为(1.365±0.102)μg·g-1,与亚微乳组相比提高了 8.32倍,相当于水溶液滴眼液最高浓度的77%。在眼后段玻璃体组织中,脂肪乳组中药物最高滞留量浓度由水溶液组中的0.5h(0.412±0.021)μg·-1延迟出现至2h(2.337±0.238)μg·g-1,但在脂肪乳组中并未能延长释放时间。实验结果也表明,无论是亚微乳组还是脂肪乳组对于眼后段晶状体中药物的分布改善作用不明显。②在体剌激性评价以乳酸林格溶液为对照,采用同体对照法对不同制剂的眼部刺激性进行评价。结果表明,亚微乳组或脂肪乳组经滴眼给药后眼部刺激性实验,按照Draize眼部刺激性评价标准,均未产生刺激性,其角膜、结膜和虹膜睫状体均无变化,所制备的制剂眼部无刺激性。5.药物动力学评价①泪液消除动力学采用泪液采集法对黄芩苷眼前段消除动力学进行评价,黄芩苷不同制剂在眼部各组织中的药物浓度随时间变化情况结果表明:与不含乳化剂的水溶液滴眼液组相比,乳化剂的存在能使药物以较快速度浓集于组织部位,而脂质材料的存在能够明显改善角膜对药物的吸收能力。将药物在角膜中的药物浓度由不含乳化剂水溶液组中的滞留量由(0.135±0.017)μg·g-1增加到含乳化剂O/W亚微乳滴眼液组的(0.995±0.045)μ g·g-1,而脂肪乳中可达(2.251±0.020)μg·g-1。可见,给药体系中处方的组成决定了药物的吸收,制备成亚微乳剂增加了黄芩苷的角膜吸收,但载体材料中含有脂质材料可使药物释放的速率减慢,延长药效起到缓释作用。结合巩膜中药物的滞留量,可证实O/W亚微乳组和脂肪乳组的释放在0～2h前呈突释效应,药物浓度随着时间的变化呈现缓慢下降的趋势。原因与脂肪乳中跨细胞的转运方式有关,而体系中含脂质材料时主要依靠网格蛋白介导的内吞作用完成转运,而以乳化剂存在的O/W亚微乳剂则以被动扩散转运的方式有关。脂肪乳中与O/W亚微乳剂所含成分主要差别在磷脂,该成分是组成生物膜的主要成分,滴眼后既能较好的与泪液相融合,并能减少亚微乳中表面活性剂的使用量,增加了角膜透过量减少了眼部刺激性的发生,但其毒性反应仍待进一步研究。②房水内动力学采用角膜穿刺法对不同剂型在房水中的药物动力学进行研究。结果表明,黄芩苷亚微乳、脂肪乳均可提高角膜滞留量,降低眼前段泪液对药物的稀释,与水溶液相比,亚微乳AUC提高了 5.89倍,脂肪乳AUC较亚微乳提高了 2.92倍。MRT与水溶液相比,亚微乳提高了近1.05倍,脂肪乳较亚微乳提高了 1.18倍,黄芩苷脂肪乳的制备,改善了药物在角膜前的生物黏附性,同时,脂质乳滴也为药物向角膜内有效传递提供了动力。房水内药动学结果表明,亚微乳及脂肪乳改变了水溶液滴眼液的眼内药物动力学,t1/2亚微乳与脂肪乳分别较水溶液提高了近3倍。③微透析取样技术在眼部应用的探索探索研究了微透析取样技术在眼部药物浓度测定中的可行性,通过对影响探针回收率的针类型、灌流液组分、灌流液速度、周围液浓度、温度等因素进行考察。不同因素的改变虽然对方法回收率均未得到改善,但该结果可为黄芩苷等低渗透性成分的体内回收率测定及体内药动学研究提供实验基础,同时也可为其它性质的药物的回收率的改善提供参考。通过对黄芩苷亚微乳的处方因素考察、制备工艺筛选、制剂表征、稳定性、眼部刺激性考察、眼球组织分布、眼前段泪液消除、房水内药物动力学的研究,表明以脂肪乳为载体的黄芩苷滴眼液更适合眼部用药。脂肪乳作为眼部给药载体具有以下优点:(1)能增加难溶性药物溶解度,可提高油水均不溶性药物的载药量;(2)使用生物相容性好的辅料,制剂安全性好,无刺激性;(3)以脂肪乳作为模型药物黄芩苷的载体,可增加药物的物理稳定性;(4)能延长药物在眼部的滞留时间,改变药物在体内的组织分布和药物动力学性质,有可能进一步开发成靶向制剂,为难溶性药物眼用给药系统的研发提供新思路。