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目的正常视网膜血管生成是血管生成刺激因子和血管生成抑制因子动态平衡的结果。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是主要的血管生成刺激因子,而色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是个强有力的抗血管生长因子。缺氧可引起VEGF表达增高和PEDF表达下降,导致视网膜新生血管生长。伴随缺氧,组织糖酵解增强,乳酸和H+产生增多而堆积。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)中血管细胞损害主要表现为周细胞的凋亡和内皮细胞的增生。糖尿病时,视网膜葡萄糖聚积增多,糖酵解增强,乳酸和H+产生也增多。本文通过视网膜培养研究了酸中毒(乳酸)在视网膜VEGF和PEDF表达调控中的作用及其机制、通过细胞培养研究了酸中毒在视网膜周细胞和内皮细胞生长和凋亡调控中的作用,以期了解缺氧和高血糖引起的视网膜血管损害中酸中毒和乳酸堆积所发挥的作用。方法1.建立视网膜培养系统。将SD大鼠视网膜培养在pH 7.2、pH 6.8和pH 6.5的环境中,以pH 7.2为正常对照,通过实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(Western blot)分析酸中毒对视网膜VEGF和PEDF表达的变化;在培养环境中加入抗氧化剂后观察氧化应激在其中的调控作用。2.建立糖尿病鼠模型,测量糖尿病鼠视网膜乳酸浓度变化;以10 mM为正常对照,观察视网膜在30 mM和50 mM乳酸浓度环境下VEGF和PEDF表达的变化。3.体外培养牛视网膜周细胞和血管内皮细胞。通过MTS、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记法、细胞周期测定和AnnexinⅤ标记观察酸中毒对周细胞和内皮细胞的增生和凋亡的影响。结果1.视网膜培养24 h后酸中毒组VEGF mRNA水平[pH 6.8组(201.33%±34.22%,P=0.000)和pH 6.5组(251.16%±28.64%,P=0.000)]较pH 7.2组(100%±14.82%)明显增加,pH 6.5组较pH 6.8组进一步升高(P=0.023);pH 6.5组PEDF mRNA水平(230.45%±66.39%)较pH 7.2组(100%±33.18%)明显增加(P=0.001);pH 7.2组、pH 6.8组和pH 6.5组VEGF/PEDF差别无统计学意义。Western blot分析酸中毒组VEGF [pH 6.8(169.07%±28.14%,P=0.004)和pH 6.5组(149.53%±16.17%,P=0.018)]和PEDF [pH 6.8(357.37%±87.94% , P=0.010)和pH 6.5组(664.41%±173.97%,P=0.000)]均较pH 7.2组明显增加。当与抗氧化剂一起孵育后,pH 6.8诱导VEGF mRNA(106%±6.5%)表达升高的作用被完全抑制,而pH 6.5(148.33%±21.50%,P=0.004)的诱导表达被部分减少;酸中毒组PEDF mRNA [pH 6.8组(282.02%±44.67%,P=0.022)和pH 6.5组(479.83%±116.94%,P=0.001)]仍明显高于pH 7.2组。2.糖尿病鼠视网膜乳酸浓度(1.97 ug/mg±0.42 ug/mg)较对照组(1.27 ug/mg±0.19 ug/mg)明显增高(p=0.004)。视网膜培养24小时后,30 mM乳酸组(1.37±0.16,P=0.001)和50 mM乳酸组(1.08±0.12, P=0.014)视网膜VEGF mRNA水平较10 mM乳酸组(0.74±0.06)明显增高,而50 mM乳酸组较30 mM乳酸组降低(P=0.025)。Western blot显示30 mM乳酸组视网膜VEGF水平较10 mM乳酸组明显增高,50 mM组稍显增加。酶联免疫吸附测定(ELISA)30 mM乳酸组(21.33 pg/mg±1.67 pg/mg,p=0.001)和50 mM组(16.93 pg/mg±1.89 pg/mg,p=0.013)培养液VEGF浓度较10 mM组(12.0 pg/mg±1.59 pg/mg)明显增高,而50 mM组较30 mM组降低(p=0.021)。高乳酸组与对照组PEDF表达差别无统计学意义。3.与pH 7.2组相比,酸中毒明显抑制周细胞和内皮细胞的活力和增生能力;周细胞凋亡率pH 6.5组(34.97%±10.54%)较pH 7.2组(11.30%±3.04%)和pH 6.8组(11.80%±4.50%)明显增加,而内皮细胞pH 6.5组(9.03%±2.08%)与pH 7.2组(22.67%±4.04%)和pH 6.8组(24.67%±8.02%)相比,细胞凋亡率明显减少。结论1.与缺氧一致,酸中毒诱导视网膜VEGF表达增加,说明在缺氧和高糖引起的视网膜新生血管病变中有酸中毒作用的参与;酸中毒诱导大鼠视网膜PEDF表达增加可能是新生血管性视网膜病变模型中大鼠不容易出现新生血管生长的原因。2.缺氧和糖尿病时视网膜乳酸堆积并诱导VEGF表达增加可能促进了血管病变的发生。3.酸中毒可引起视网膜周细胞凋亡而抑制内皮细胞凋亡的作用表明视网膜酸中毒也介入了糖尿病视网膜病变的发生。酸中毒影响视网膜血管病变的作用的揭示为推动糖尿病视网膜病变的防治研究开拓了一条新思路。