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本文以Ⅱa类细菌素及其敏感菌李斯特菌为主要研究对象。首先提取获得具有生物学活性的Ⅱa类细菌素,通过诱导获得抗性的李斯特菌,比较敏感菌株与抗性菌株在生长代谢上的差异,继而进一步研究其抗性产生的机理。研究结果有利于阐明细菌素的作用机制,为其未来在食品中的应用提供理论依据,为后续相关研究提供参考。本文主要内容如下:1.提取细菌素并测定抑菌活性。分别采用硫酸铵沉淀法、酸沉淀法、Yang氏吸附法对植物乳杆菌、弯曲乳杆菌和乳酸片球菌的细菌素进行提取。植物乳杆菌素的最适提取方法是硫酸铵沉淀法,在硫酸铵浓度为70%时提取效果最佳。乳酸片球菌和弯曲乳杆菌细菌素最适提取方法为Yang氏吸附法。单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌和无害李斯特菌对上述三种细菌素均表现出敏感性,其中以单增李斯特菌做为指示菌测定的乳酸片球菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌细菌素的效价分别为640 AU/mL、320 AU/mL和320 AU/mL。2.抗性菌株的诱导及抗性分析。采用片球菌素诱导单核细胞增生李斯特菌,抗性产生频率为10-5,得到两株具有稳定抗性的菌株。牛津杯法测定细菌素活性,结果显示抗性菌株对含有细菌素的中和发酵上清液不敏感,但对nisin的敏感性无变化;通过测定菌株生长曲线发现,在不含片球菌素的条件下,原始菌株在对数期生长速率高于抗性菌株,抗性菌株对数期延后且最终菌液浓度高于原始菌株。当含有不同浓度片球菌素时,原始菌株被明显抑制,而抗性菌株仍表现出生长趋势,但出现菌液浓度低于未添加片球菌素的情况;原始菌株利用葡萄糖和甘露糖时达到稳定期的时间快于抗性菌株,而抗性菌株利用纤维二糖后生长速率更快。3.抗性机理研究。测定了菌株细胞表面疏水性、细胞对溶菌酶敏感性、菌体自身吸附作用、菌株分泌酶作用和调控基因的验证等,结果显示随着抗性的产生,菌株细胞表面疏水性提高;生物成膜性随抗性的产生而降低;抗性菌株对细菌素的吸附能力下降,对溶菌酶敏感性无明显差异,且不能分泌使细菌素失活的酶类。对菌株中两个调控基因lmo0095和resD进行扩增后,测序结果表明,原始菌株与抗性菌株中的序列一致。4.目的基因在重组菌中的克隆表达。将甘露糖磷酸转移酶系统的mptC和mptD基因扩增,分别获得大小约800 bp和900 bp的目的片段,连接T载体构建重组克隆质粒pMD19-mptC和pMD19-mptD,同时分别与双酶切的pET32a（+）和pNZ8048载体连接、转化,构建重组表达质粒pET32a-mptC/pET32a-mptD,pNZ8048-mptC/pNZ8048-mptD。pET32a-mptC/pET32a-mptD转化宿主菌大肠杆菌B121（DE3）后得到重组蛋白TrxA-MptC、TrxA-MptD,经IPTG诱导后,出现分子质量约为50 kDa的重组蛋白条带。pNZ8048-mptC/pNZ8048-mptD电转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞,成功获得重组菌株。通过nisin诱导后测定生长曲线,NZ9000（pNZ8048-mptC）菌株生长速率及生长量均随nisin诱导浓度的提高而增高,当诱导浓度为10 ng/mL时生长情况最佳;NZ9000（pNZ8048-mptD）菌株在5 ng/mL的nisin诱导浓度时生物量最高。当存在细菌素时,高浓度（≥5 ng/mL）nisin诱导后的重组菌株生长受到抑制,并均对细菌素表现出敏感性。